糖基轉移酶β3Gn-T8與轉錄因子c-Jun的相關性及其與胃癌侵襲的關系.pdf

1、目的:
　　 根據(jù)已有文獻報道:當細胞癌變時，細胞糖復合物上的糖鏈結構常發(fā)生變化，而這種變化來源于合成該糖鏈的相應糖基轉移酶表達的改變。β1，3-N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶(β3Gn-Ts)家族是糖基轉移酶的重要成員，β3Gn-Ts家族參與合成其產(chǎn)物中的β1，3-乙酰氨基葡萄糖連接鍵，其成員β3Gn-T8參與合成糖蛋白上N-連接型糖鏈中的多聚乳糖胺結構。本課題組先前研究證明，β3Gn-T8與胃癌的增殖侵襲轉移密切相關，可能通過對基

2、質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2表達的調(diào)控促進胃癌的侵襲作用，因此，對MMP-2表達的調(diào)控通路有望作為控制胃癌侵襲轉移的新靶點。本研究分析β3Gn-T8上游調(diào)控序列啟動子區(qū)，發(fā)現(xiàn)β3Gn-T8啟動子有五個c-Jun和一個Ets-1和結合位點。為了進一步闡明β3 Gn-T8與胃癌的侵襲轉移的相關性，本研究以體外培養(yǎng)的人胃癌SGC7901細胞株為研究對象，探討胃癌SGC7901細胞株中轉錄因子c-Jun對糖基轉移酶β3Gn-T8的轉錄調(diào)控;c-Jun

3、基因沉默后對β3Gn-T8的表達以及對胃癌SGC7901細胞生物學行為的影響。同時在由10例臨床標本制作成的組織芯片上檢測c-Jun、CD147和多聚乳糖胺糖鏈的表達，對在臨床胃癌標本中c-Jun、β3Gn-T8、多聚乳糖胺糖鏈和CD147的表達相關性進行探討，以期為胃癌的治療提供新的途徑。
　　 方法:
　　 1.RT-PCR檢測c-Jun和β3Gn-T8在SGC7901等六種腫瘤細胞株中的表達情況。
　　 2

4、.采用c-Jun中等量表達和β3Gn-T8高表達的人胃癌SGC7901細胞株為研究對象。應用三種生物信息學軟件對β3Gn-T8啟動子區(qū)的轉錄因子c-Jun基因的結合位點進行預測，根據(jù)預測結果構建β3Gn-T8啟動子區(qū)系列截短體，并構建c-Jun基因的正義表達載體，經(jīng)酶切、測序鑒定重組質(zhì)粒的序列;應用雙熒光素酶報告基因技術分析β3Gn-T8啟動子區(qū)系列截短體的轉錄激活活性;并進一步采用染色質(zhì)免疫沉淀( ChIP)檢測分析c-Jun蛋白與β

5、3Gn-T8基因DNA的結合。
　　 3.設計并構建4條針對c-Jun mRNA靶點的siRNA真核表達質(zhì)粒載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA，同時設計shRNA-無關序列作為陰性對照(negative control，NC)，并構建表達載體;培養(yǎng)SGC7901細胞，以脂質(zhì)體法轉染細胞，熒光顯微鏡觀察以最高轉染效率和最低細胞死亡率為原則，優(yōu)化轉染條件，根據(jù)優(yōu)化的條件將pGPU6/GFP/Neo-shRNA質(zhì)粒轉染胃癌SG

6、C7901細胞，應用RT-PCR和western blot方法在mRNA水平和蛋白水平上檢測四組pGPU6/GFP/Neo-shRNA對c-Jun基因表達的抑制作用，篩選出干擾效果最好的一組表達載體用于后續(xù)實驗;設計空白對照組(Blank組，SGC7901細胞株)、陰性對照組(NC組，pGPU6/GFP/NC質(zhì)粒轉染的SGC7901細胞)、c-Jun-shRNA組(pGPU6/GFP/c-Jun-shRNA質(zhì)粒轉染的SGC7901細胞)

7、為研究對象，經(jīng)G418篩選，獲得穩(wěn)定轉染表達載體pGPU6/GFP/c-Jun-shRNA的SGC7901細胞;應用RT-PCR和western blot方法在mRNA水平和蛋白水平上檢測c-Jun基因沉默后β3Gn-T8的表達;應用CCK-8試劑盒檢測三組細胞的增殖能力;應用凝集素細胞免疫熒光和FITC標志的凝集素流式細胞術檢測三組細胞多聚乳糖胺糖鏈的表達。
　　 4.通過免疫組織化學方法檢測c-Jun、CD147和多聚乳糖胺

8、糖鏈在由10例人胃癌組織和10例癌旁非腫瘤胃組織制作而成的組織芯片上的表達，以對在臨床胃癌標本中c-Jun、β3Gn-T8、多聚乳糖胺糖鏈及與CD147和MMP-2表達相關性進行探討。
　　 結果:
　　 1.C-Jun和β3Gn-T8在腫瘤細胞株中的表達:我們檢測了胃癌細胞株SGC7901及AGS、惡性腦膠質(zhì)瘤細胞株U87及LN229、乳腺癌細胞株MCF-7及MDA-MB-231中均有不同程度的表達，其中，胃癌SGC7

9、901細胞株中c-Jun呈中等表達水平，β3Gn-T8呈高表達。
　　 2.生物信息學分析:AliBaba2.1、PATCH和TESS三種在線軟件預測結果分析β3Gn-T8啟動子區(qū)存在著c-Jun基因的多個結合位點;雙熒光素酶報告基因顯示c-Jun對β3Gn-T8啟動子區(qū)具有轉錄激活作用，其中啟動子區(qū)-561/+8片段的轉錄活性最高，且對c-Jun呈劑量依賴性;ChIP檢測發(fā)現(xiàn):活化的c-Jun蛋白與β3Gn-T8基因的DNA片

10、段有相互結合。
　　 3.shRNA表達載體的構建及其對胃癌生物學行為的影響:靶向c-Jun mRNA的四個pGPU6/GFP/Neo-shRNA重組質(zhì)粒表達載體經(jīng)酶切、測序鑒定，證實載體構建成功;重組質(zhì)粒表達載體通過脂質(zhì)體介導轉染人胃癌SGC7901細胞，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，RT-PCR和 western blot結果證實pGPU6/GFP/Neo-shRNA-1949對c-Jun表達抑制的效果最好，因此，選擇該sh

11、RNA載體，構建后續(xù)對c-Jun穩(wěn)定下調(diào)的穩(wěn)定細胞株;RT-PCR和western blot方法檢測鑒定c-Jun基因沉默后SGC7901細胞株中β3Gn-T8基因在mRNA水平和蛋白水平表達均下降;CCK-8實驗結果顯示c-Jun基因沉默后SGC7901細胞增殖能力明顯下降;凝集素細胞免疫熒光和流式細胞術檢測結果顯示c-Jun基因沉默后β3Gn-T8表達下降導致細胞上多聚乳糖胺糖鏈的表達量降低。
　　 4.C-Jun、CD14

12、7和多聚乳糖胺鏈在胃癌組織的表達:結果顯示c-Jun在胃癌組織的表達顯著高于癌旁非腫瘤胃組織;CD147在胃癌組織高表達，而在癌旁非腫瘤胃組織幾乎無表達;凝集素結合的多聚乳糖胺糖鏈表達在胃癌細胞和胃粘膜上皮細胞的胞漿中，棕黃色顆粒狀。在彌漫型胃癌中的表達呈深棕色，而在腸型胃癌的表達為淺棕色，在某些腸型胃癌的癌細胞腺腔側的胞漿及胞膜中呈深棕色顆粒狀強陽性表達。在腸型胃癌的腺腔中和印戒細胞癌的粘液池中有強陽性顆粒。而在癌旁非腫瘤胃組織上皮細

13、胞中的著色強度及范圍明顯弱于胃癌細胞。此外，在低分化腺癌中表達較高，而在高分化腺癌中表達較低。
　　 結論:
　　 1.C-Jun和β3Gn-T8在六種腫瘤細胞株中均有表達，胃癌SGC7901細胞株中c-Jun呈中等表達量，β3Gn-T8呈高表達;
　　 2.生物信息學軟件預測結果顯示β3Gn-T8啟動子區(qū)存在著轉錄因子c-Jun的多個結合位點;雙熒光素酶報告基因結果顯示c-Jun對β3Gn-T8啟動子區(qū)具有轉錄

14、激活作用，啟動子區(qū)-561/+8片段的轉錄活性最高，且對c-Jun呈劑量依賴性;ChIP結果顯示c-Jun蛋白結合至β3Gn-T8基因的DNA片段。因此，c-Jun參與了胃癌SGC7901細胞株中β3Gn-T8基因的表達調(diào)控，至少是調(diào)控因素之一。且呈正性調(diào)控作用。
　　 3.針對c-Jun基因的pGPU6/GFP/Neo-c-Jun-shRNA表達載體構建成功，經(jīng)過檢驗，pGPU6/GFP/Neo-shRNA-1949對SGC7

15、901細胞中c-Jun抑制效果最明顯;并穩(wěn)定轉染SGC7901細胞株，獲得c-Jun穩(wěn)定下調(diào)的SGC7901細胞株，下調(diào)c-Jun基因表達后可降低胃癌SGC7901細胞株中β3Gn-T8基因在mRNA水平和蛋白水平上的表達;進而抑制胃癌SGC7901細胞的增殖能力以及細胞多聚乳糖胺糖鏈的合成。
　　 4.C-Jun、CD147及多聚乳糖胺糖鏈結構在人胃癌組織的表達較癌旁非腫瘤胃組織顯著增加。在彌漫型胃癌中多聚乳糖胺糖鏈結構的表達

16、要強于腸型胃癌。
　　 綜上所述，轉錄因子c-Jun對胃癌SGC7901細胞株中糖基轉移酶β3Gn-T8的啟動子區(qū)有轉錄調(diào)控作用，且呈正性調(diào)控作用;c-Jun基因沉默后能夠抑制胃癌SGC7901細胞株中糖基轉移酶β3Gn-T8的表達，抑制胃癌細胞的增值能力，并且降低胃癌細胞上多聚乳糖胺糖鏈的合成，從而抑制胃癌細胞的侵襲轉移能力;在10例胃癌病例的癌組織標本中，c-Jun、CD147及多聚乳糖胺糖鏈結構均明顯高表達，其趨勢與胃癌細