結腸癌中β3GnT8與轉錄因子c-jun的相關性探討及其在侵襲遷移進程中的功能研究.pdf

1、目的：
　　探究轉錄因子c-jun對糖基轉移酶β3GnT8的轉錄調(diào)控作用及研究β3GnT8與c-jun在結腸癌侵襲遷移中的分子機制。
　　方法：
　?。?）培養(yǎng)三種人結腸癌細胞株SW620、SW480、LoVo，并通過Western-blot檢測這三種結腸癌細胞中c-jun和β3GnT8蛋白的表達水平及通過Transwell法檢測c-jun和β3GnT8高、低表達的細胞在24h時的侵襲遷移能力；
　?。?）ChI

2、P技術檢測c-jun與β3GnT8基因啟動子區(qū)的結合作用；
　?。?）將c-jun過表達質(zhì)粒、c-jun shRNA干擾載體及其空載體通過lip2000脂質(zhì)體介導的方法分別轉染至c-jun和β3GnT8蛋白的表達低的SW480細胞和表達程度高的LoVo細胞中；
　?。?）熒光顯微鏡觀測轉染帶有GFP標記載體的細胞株，Real time-PCR及Western-blot檢測轉染后SW480中c-jun上調(diào)后和LoVo細胞中c-

3、jun下調(diào)后β3GnT8、CD147以及相關分子的mRNA和蛋白的表達變化；
　?。?）流式細胞術檢測c-jun對β3GnT8參與合成的細胞表面多聚乳糖胺糖鏈的表達水平；
　?。?）Transwell和細胞劃痕修復實驗檢測SW480中c-jun上調(diào)后和 LoVo中 c-jun下調(diào)后，對細胞侵襲和遷移能力的影響；
　　（7）篩選獲得β3GnT8和β3GnT2基因的有效siRNA片段；
　　（8）將c-jun過表達載

4、體與篩選獲得的β3GnT8、β3GnT2基因的最有效干擾片段通過脂質(zhì)體介導共轉染結腸癌SW480細胞，RT-PCR檢測β3GnT8mRNA的表達變化，并通過Transwell檢測各組細胞的遷移能力。
　　結果：
　?。?）Western-blot檢測三株結腸癌細胞株中c-jun和β3GnT8的蛋白表達水平由低到高依次為SW480→SW620→LoVo，Transwell結果顯示24h時SW480細胞轉移細胞數(shù)極少，而LoVo

5、轉移細胞數(shù)很多；
　?。?）ChIP實驗結果顯示c-jun與β3GnT8基因啟動子區(qū)有相互結合；
　?。?）通過熒光顯微鏡觀察、Real time-PCR及Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)SW480中 c-jun上調(diào)后，與空白對照組相比，β3GnT8、HG-CD147及MMPs的mRNA和蛋白表達水平均升高；LoVo細胞中c-jun下調(diào)后，與空白對照組相比，β3GnT8、HG-CD147及MMPs的mRNA和蛋白表達水平均下

6、降；
　　（4）流式細胞術實驗結果顯示，SW480中c-jun上調(diào)后，與空白對照組相比，細胞表面多聚乳糖胺鏈含量增加；LoVo細胞中c-jun下調(diào)后，與空白對照組相比，細胞表面多聚乳糖胺鏈含量降低；
　　（5）細胞劃痕損傷修復實驗顯示SW480中c-jun上調(diào)后，與空白對照組相比，損傷程度變小，提示細胞遷移能力增強；而LoVo細胞中c-jun下調(diào)后，與空白對照組相比，損傷程度變大，提示細胞遷移能力降低；
　?。?）Tr

7、answell小室檢測發(fā)現(xiàn)SW480中c-jun上調(diào)后，與空白對照組相比，穿膜細胞數(shù)明顯增多，提示細胞侵襲和遷移能力增強；而LoVo細胞中c-jun下調(diào)后，與空白對照組相比，穿膜細胞數(shù)明顯降低，提示細胞侵襲和遷移能力降低。
　?。?）Real time-PCR篩選獲得siβ3GnT8-1754和siβ3GnT2-1336兩個最有效干擾片段，與c-jun過表達載體共轉染 SW480細胞后，RT-PCR檢測結果顯示，與單獨轉染siβ3

8、GnT8-1754和siβ3GnT2-1336組相比，共轉染組β3GnT8 mRNA的表達升高，且高于未處理組；并用 Transwell檢測發(fā)現(xiàn)共轉染組穿膜細胞數(shù)較 c-jun過表達組明顯減少，較單獨轉染siβ3GnT8-1754和siβ3GnT2-1336組升高。
　　結論：
　?。?）三株結腸癌細胞株中c-jun和β3GnT8的蛋白表達水平由低到高依次為SW480→SW620→LoVo。
　?。?）轉錄因子c-ju