抗棗瘋病相關(guān)蛋白的雙向電泳分析.pdf

1、棗(Ziziphus jujuba Mill.)是我國(guó)重要的特色和優(yōu)勢(shì)果樹(shù)樹(shù)種。棗瘋病是由植原體(Phytoplasma)引起的致死性傳染病害，對(duì)棗產(chǎn)業(yè)危害極大。本課題組最近在國(guó)內(nèi)外首次選育出了高抗棗瘋病新品種“星光”，為揭示其抗病機(jī)制，本研究利用雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)，對(duì)其在植原體侵染前后不同時(shí)期的蛋白進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，旨在尋找抗棗瘋病相關(guān)蛋白，進(jìn)而通過(guò)氨基酸序列預(yù)測(cè)基因序列，為抗病基因克隆奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下: l建立

2、了棗韌皮部蛋白的雙向電泳體系本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)TCA-丙酮法和甲醇/醋酸銨法的比較，確定甲醇/醋酸銨法適宜棗韌皮部總蛋白提取，可解決棗枝皮中多糖、色素等對(duì)雙向電泳的干擾問(wèn)題。 適宜的蛋白上樣量為380μL(約200 ug)，最佳平衡時(shí)間為30min～40min，第二向SDS-PAGE電泳的最佳電泳值為200V；通過(guò)考馬斯亮藍(lán)和硝酸銀染色方法的比較，確定了硝酸銀染色適宜于棗韌皮部蛋白染色。 確定了棗韌皮部蛋白主要集中在pI4～7

3、之間。利用本試驗(yàn)建立的蛋白質(zhì)提取及雙向電泳體系，對(duì)棗韌皮部蛋白采用pH4～7的線性IPG膠條進(jìn)行分離，經(jīng)硝酸銀染色后獲得了重復(fù)性好、分辨率高的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，經(jīng)PDQuest圖像分析軟件處理，得到500～700個(gè)可識(shí)別的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。 2棗瘋病抗性相關(guān)蛋白分析通過(guò)單向電泳分析，發(fā)現(xiàn)在棗瘋病病樹(shù)上嫁接的“星光”接穗與健康樹(shù)上相比，在70d、90d時(shí)沒(méi)有明顯差異，而在嫁接后110d時(shí)，有三條譜帶(分子量為31.2 kDa、30.4

4、 kDa、29.0 kDa)表達(dá)量顯著增加。 通過(guò)雙向電泳和蛋白斑點(diǎn)比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)棗瘋病病樹(shù)上嫁接的“星光”接穗在嫁接后90d及110d時(shí)，在酸性端出現(xiàn)一隨發(fā)育階段后延而表達(dá)增強(qiáng)的區(qū)域(分子量27～32KD、等電點(diǎn)pI4.2～5.0)，在對(duì)照健康樹(shù)上嫁接的接穗均沒(méi)有此變化。此結(jié)果與單向電泳結(jié)果一致。 確定了與棗瘋病抗性相關(guān)的蛋白范圍為分子量27～32KD、等電點(diǎn)pI4.2～5.0。 3獲得了3個(gè)同源性較好的蛋白序