缺氧預處理骨髓間充質(zhì)干細胞對大鼠心梗后心室重構(gòu)的影響及機制研究.pdf

1、急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI),導致了心肌細胞的不可逆的損傷和丟失以及瘢痕的形成,發(fā)生心室重構(gòu)(ventricular remodeling),造成充血性心力衰竭.一致認為干細胞(stem cells)有能力促使組織的再生,修復受損的心肌,在基礎(chǔ)和臨床的研究中骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem.cells,MSCs)被認為能有效的治療心肌梗死. 干細胞治療心肌梗死,潛

2、在的機制包括直接再生丟失的心肌細胞,和心臟組織的其他類型細胞,但對此也存在著許多爭論.移植細胞的低活力限制了有意義的心肌的再生.研究表明通過基因修飾可以增強心肌細胞的保護作用,然而,其安全性和有效性仍然是有爭論的. 以前的報道表明,缺氧在胎盤的發(fā)育過程中有著及其重要的作用,早期人類胚胎就發(fā)生在一個非常低的氧濃度的環(huán)境中.MSCs定居的骨髓也是一個含氧量低的環(huán)境,當MSCs的氧濃度減少到5﹪時增加了它們骨形成的能力,用缺氧刺激MS

3、Cs增加了它們旁分泌的作用. 我們假設(shè)MSCs部分通過旁分泌作用保護缺血心肌,且對細胞進行預處理可增加保護缺血心肌的作用,這部分通過增加旁分泌實現(xiàn).我們在移植前用缺氧預刺激MSCs,通過在體外和體內(nèi)的研究以進一步明確其心臟保護作用及其機制. 材料和方法: 體外實驗:分別取16-18周齡的雄性SD大鼠的骨髓,體外分離、擴增培養(yǎng)MSCs.建立MSCs缺氧模型,留取缺氧3h的MSCs培養(yǎng)基作為后續(xù)實驗用,采用分次消化法

4、分離獲取SD乳鼠的心肌細胞,以差速貼壁法和Brdu抑制法提純心肌細胞.十天后,取第一代心肌細胞進入實驗,體外實驗時,心肌細胞隨機分為四組:分別用MSCs培養(yǎng)基、缺氧預處理.MSCs培養(yǎng)基(AP-MSCs培養(yǎng)基),DMEM替代標準培養(yǎng)基,缺氧24小時,對照組在含20﹪胎牛血清的DMEM中標準條件下培養(yǎng)24小時,流式細胞儀檢測心肌細胞的凋亡率. 體內(nèi)實驗:成年雄性SD大鼠52只,體重250+30g,分4組,每組13只,培養(yǎng)基DMEM

5、組(G-1)、AP-MSCs培養(yǎng)基組(G-2)、MSCs組(G-3)、AP-MSCs組(G-4).開胸結(jié)扎左冠狀動脈前降支,建立急性心梗模型.一周后再次開胸,G-3組、G-4組將相應(yīng)的5×10<'6>的MSCs、AP-MSCs(150μl濃縮DMEM稀釋)分點注射到大鼠心臟梗死邊緣區(qū);G-1組、G-2組注射等量的濃縮100倍的DMEM、AP-MSCs培養(yǎng)基.一周后,每組處死5只動物,取出心臟,左心室按標準的病理技術(shù)切片,行TUNEL染色

6、評估心肌梗死后凋亡心肌細胞.蛋白免疫印記檢測凋亡相關(guān)蛋白BCL-2、BAX.4周后,剩余老鼠采用超聲心動圖評估心功能,處死動物,取出心臟,病理切片,行HE染色,改良masson三色染色,測量膠原含量,進行血管計數(shù). 結(jié)果:體外實驗AP-MSCs培養(yǎng)基能減少缺氧后心肌細胞的凋亡,但是MSCs培養(yǎng)基不能.體內(nèi)實驗1、與G1組相比,G2、G3、G4組左室舒張末期和收縮末期內(nèi)徑縮短(G-1:0.75±0.06 vs G-2: 0.63±

7、0.02; G-3:0.57±0.02; G-4:0.49±0.03,p<0.01;G-1:0.60±0.05 vs G-2: 0.40±0.02; G-3:0.36±0.02; G-4:0.28±0.02,p<0.05),短軸縮短率明顯增加,心功能改善.以G4組最為明顯 (G-1:20.94±1.20 vsG-2:36.4±2.39G-3:37.12±2.00 G-4:43.32±1.82, p<0.05.G-4 vs G-2,p<0

8、.05). 2、與G1組相比,G2、G3、G4組心肌細胞的凋亡明顯減少(G-1:15.09±1.76vs G-2: 8.97±3.21; G-3:11.77±4.05; G-4:7.93±1.47,p<0.05), 尤以G4組最為明顯 (G-4 vs G-3, p<0.05) .上調(diào)了BCL-2的表達. 3、與G1組相比,G2、G3、G4組細胞外基質(zhì)膠原形成明顯減少(G-1:40.86±4.82vsG-2:32.93±3

9、.15; G-3:33.07±6.95; G-4:27.57±4.14,p<0.05), 以G4組最為明顯 (G-4vs G-2; G-3,p<0.05)血管周圍膠原沉積減少,G4組血管密度上調(diào)(3-4:6.10±0.23 vs G-1:4.88±0.37; G-2:5.13±0.34; G-3:4.78±0.27,p<0.05). 結(jié)論: 1、MSCs移植可以減少心肌細胞的凋亡,促進血管的生成,減少基質(zhì)膠原形成,延緩心