分枝桿菌RskA蛋白不同表達水平的生理效應分析.pdf

1、目前全球人群結核分枝桿菌感染嚴重，約有20億人（世界人口的三分之一）已經(jīng)感染了結核分枝桿菌。雖然國際社會一直給予極大的關注，各國政府也一直致力于結核病防治工作，結核病仍然嚴重危害著人們的健康。特別是近年來耐藥結核菌株的出現(xiàn)和HIV共感染更使得結核防治工作變得任重道遠。
　　對于流行疾病的控制，有效的早期診斷和早期治療無疑是整個防治環(huán)節(jié)中的首選切入點。鑒于此，開發(fā)新的抗結核的藥物和疫苗，顯得尤為迫切。但目前，對于結核桿菌致病、耐藥和

2、潛伏的機制尚不明了。對相關機制的探究，將會幫助我們更好的了解結核病與結核分枝桿菌，也將為藥物和疫苗的研發(fā)打下堅實基礎。
　　結核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中存在著大量可以被CD8+T細胞所識別的蛋白抗原。MPB70和MPB83就是結核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中的主要分泌蛋白，也是一類保護性抗原。而MPB70和MPB83抗原蛋白的表達受到sigK(Rv0445c)的調節(jié)作用。與其臨近的Rv0444c基因編碼anti-sigK因子RskA，可以抑制Si

3、gK的功能。同時，我們在做前期臨床菌株分型的過程中，注意到部分臨床菌株中Rv0444c（242位）發(fā)生了單堿基突變(G→C)，導致其編碼的81位密碼子由谷氨酸突變?yōu)樘於彼岬腻e義突變。這一突變導致了anti-SigK因子失活，從而解除了對SigK的抑制，最后導致了抗原蛋白MPB70和MPB83發(fā)生表達變化。
　　而MPB70和MPB83又是一組與細菌毒力有關聯(lián)性的抗原蛋白。因此我們希望通過此次實驗，嘗試揭示不同RskA表達情況，以

4、及242位錯義突變對菌株毒力和胞內存活能力的影響，為更進一步研究結核分枝桿菌毒力、探究結核病發(fā)病機制做一些鋪墊。
　　本實驗構建了RskA高表達菌株(RskA-High)、RskA低表達株(RskA-Low)、突變株(RskA-Mut)，以及pMV261、pACT空質粒重組對照菌株，觀察發(fā)現(xiàn)不同RskA蛋白表達水平對菌體、菌落形態(tài)無明顯影響。而不同條件環(huán)境下胞外群體生長情況差異，和不同菌株胞內生長情況的差異顯示，RskA-High

5、菌株在胞內/低氧環(huán)境中表現(xiàn)出更好的適應性。RskA-Low菌株則表現(xiàn)出對胞內/低氧環(huán)境的不耐受。
　　而RskA不同表達水平的各菌株攻擊THP1細胞后，刺激誘導TNF-α水平的差異證實，RskA-High菌株刺激THP1細胞分泌TNF-α量更少，初步佐證了RskA-High菌株RskA蛋白高表達后抑制SigK因子，并負向調控毒力相關蛋白MPB70、MPB83。而菌株毒力的下降，使得菌株刺激細胞因子分泌的能力下降，從而更容易在胞內實

6、現(xiàn)免疫逃逸，顯示出較為良好的適存能力。
　　為進一步獲得佐證，基于RskA低表達菌株在胞內無法正常生長，我們選擇了RskA-High、RskA-Mut和pMV261空質粒對照菌株，采取尾靜脈注射的方式攻擊C57BL/6小鼠，同時設置PBS組等量注射作為對照。7d、14d、21d、28d分批處死小鼠，觀察活力情況變化、臟器和尾部表觀變化，并對肺脾組織進行固定制片，通過HE染色進行病理檢測分析。小鼠臟器超微結構的變化差異，顯示出Rsk

7、A-High菌株對小鼠臟器造成的損害較輕，提示RskA-High菌株毒力相對較弱，也進一步證實了RskA對于結核分枝桿菌MPB70和MPB83兩種蛋白表達情況的負調控。
　　綜上所述，我們對RskA/SigK調節(jié)毒力相關蛋白進行了實驗驗證，通過胞內外細菌的培養(yǎng)情況，確認了RskA高表達菌株表現(xiàn)出更強的胞內生存能力。菌株攻擊細胞后相關細胞因子的檢測和小鼠的病理檢測結果也顯示，這一適應性是RskA高表達菌株通過負調控毒力相關蛋白，使得