電針預處理通過調節(jié)CB2R-EAAT2產(chǎn)生腦缺血耐受作用.pdf

1、腦缺血損傷時,組織會釋放大量游離的興奮性氨基酸,主要是谷氨酸,它們作用于突觸后膜的谷氨酸受體N-methyl-D-aspartate(NMDA),使其過度激活,通過谷氨酸受體依賴的離子通道開放引起鈣超載,導致神經(jīng)元發(fā)生壞死或凋亡,加重繼發(fā)性腦損傷。由于神經(jīng)元內缺乏可降解谷氨酸的酶類,所以谷氨酸的清除主要是依靠神經(jīng)元和膠質細胞膜上的谷氨酸轉運系統(tǒng)。谷氨酸被神經(jīng)元和膠質細胞膜上的興奮性谷氨酸轉運體(EAATs)轉運至細胞內,在谷氨酰胺合成酶

2、的作用下轉化為谷氨酰胺,后者再被轉運回神經(jīng)元內[1]。EAATs分為EAAT1-5型,其中EAAT2在皮層和紋狀體較豐富,且僅表達于膠質細胞。腦缺血損傷時,谷氨酸轉運體的90％由EAAT2完成,是最主要的谷氨酸轉運體[2]。大鼠腦卒中后給予電針治療,可以顯著增加EAAT2的表達水平,增強谷氨酸的重攝取功能,產(chǎn)生神經(jīng)保護作用[3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),電針(Electroacupuncture,EA)預處理可以激活大鼠腦缺血組織中CB2受體

3、發(fā)揮神經(jīng)保護作用[4]。據(jù)報道,小膠質細胞和星形膠質細胞均有CB2受體表達[5]。同時,本課題組前期試驗利用細胞培養(yǎng)技術,發(fā)現(xiàn)給予CB2受體激動劑AM1241預處理可以減輕脂多糖(LPS)和γ-干擾素(IFN-γ)引起的小膠質細胞活化和損傷作用[6];同時也可以減輕由谷氨酸介導引起的小膠質細胞活化和損傷作用[7]。
　　電針預處理產(chǎn)生的神經(jīng)保護作用已明確與CB2受體相關。與此同時,電針治療作用又與調節(jié)谷氨酸攝取和降解有關,但目前關

4、于電針預處理激活CB2受體后如何發(fā)揮作用還不清楚,因此,我們推測電針預處理激活CB2受體可能作用于EAAT2發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本實驗利用C57BL/6小鼠全腦缺血損傷模型,對此假說進行驗證。
　　實驗一EAAT2在電針預處理誘導神經(jīng)保護的研究目的:
　　驗證電針預處理作用,觀察EAAT2是否參與電針預處理誘導的神經(jīng)保護作用。
　　方法:
　　成年雄性C57BL/6小鼠64只,隨機分為8組(n=8):假手術組(Sh

5、am組)、對照組(Con組)、頭孢曲松鈉組(CeftriaxoneSodium,CXT組)、溶劑組(V組)、電針預處理組(EA組)、Dihydrokainate+電針組(DHK+EA組)、DHK溶劑+電針組(V+EA組)和DHK組。CXT組術前連續(xù)5d腹腔注射CXT600mg/kg,V組給予等容量CXT溶劑生理鹽水0.1mL,DHK組缺血前1h側腦室單次注射DHK200ug/kg;EA組、DHK+EA和V+EA組麻醉后接受電針刺激“百會

6、穴”,選用疏密波、頻率2/15Hz、電流強度1mA,30min/天,連續(xù)5天。除Sham組外,各組動物處理完成后24h用雙側頸總動脈阻塞(BCCAO)方法制備小鼠全腦缺血再灌注損傷模型,缺血20min。DHK+EA組和V+EA組分別于缺血前1h側腦室注射DHK200ug/kg或等容量溶劑生理鹽水2uL。各組動物再灌注24h后行神經(jīng)行為學評分,然后處死,取腦組織,HE染色,光鏡下觀察細胞形態(tài),進行海馬CA1區(qū)損傷神經(jīng)元計數(shù)。
　　結

7、果:
　　1.EAAT2激動劑CXT預處理可以減輕C57BL/6小鼠的全腦缺血損傷
　　小鼠神經(jīng)行為學評分和海馬CA1區(qū)組織病理學結果:與Sham組比較,Con組小鼠神經(jīng)功能學評分顯著降低(P<0.05),損傷神經(jīng)元數(shù)目增多(P<0.05);與Con組比較,CXT組可明顯增加神經(jīng)行為學評分(P<0.05),減少損傷神經(jīng)元細胞數(shù)目(P<0.05),V組神經(jīng)功能學評分和損傷的神經(jīng)元數(shù)目沒有變化(P>0.05)。
　　2.E

8、AAT2拮抗劑DHK可以逆轉電針預處理產(chǎn)生的腦缺血耐受作用
　　小鼠神經(jīng)行為學評分和CA1區(qū)組織病理學結果:與Sham組比較,Con組神經(jīng)功能學評分顯著降低(P<0.05),損傷神經(jīng)元數(shù)目增多(P<0.05);與Con組比較,EA組和V+EA組可明顯提高神經(jīng)行為學評分(P<0.05),降低損傷神經(jīng)元的數(shù)目(P<0.05);與EA組比較,DHK+EA組神經(jīng)行為學評分明顯降低(P<0.05),損傷神經(jīng)元數(shù)目增加(P<0.05),但V+

9、EA組與EA組比較,的神經(jīng)功能學評分沒有改變和損傷神經(jīng)元數(shù)目也沒有差異(P>0.05)。
　　結論:
　　電針預處理可改善腦缺血損傷作用,提高小鼠神經(jīng)行為學評分和降低損傷神經(jīng)元的數(shù)目。腦缺血前給予EAAT2的拮抗劑DHK可以明顯逆轉電針預處理的神經(jīng)保護作用。而EAAT2激動劑CXT預處理也可增加全腦缺血模型小鼠的神經(jīng)行為學評分和降低損傷神經(jīng)元的數(shù)目,提示EAAT2參與了電針預處理誘導產(chǎn)生的神經(jīng)保護作用。
　　實驗二CB

10、2R/EAAT2在電針預處理誘導腦缺血耐受作用的研究目的:
　　驗證CB2參與電針預處理產(chǎn)生的腦缺血耐受作用,進一步探討電針預處理激活CB2受體后是否調節(jié)膠質細胞膜上的EAAT2發(fā)揮腦缺血耐受作用。
　　方法:
　　成年雄性C57BL/6小鼠136只,隨機分為11組:Sham組、Con組、EA組、AM630+EA組、溶劑+電針組(V+EA組)、AM1241組、溶劑組(V組)、ACEA組、AM251+EA組、AM630組

11、和AM251組。AM1241組、ACEA組、V組、AM630組和AM251組分別于缺血前連續(xù)5d腹腔注射AM1241、ACEA或等容量溶劑,AM6303mg/kg和AM2511mg/kg;EA組、AM630+EA組、AM251+EA組和V+EA組麻醉后接受電針刺激“百會穴”,參數(shù)同實驗一,并于電針前3h和30min分別腹腔注射AM251和AM630及其溶劑。處理完成后24h制備小鼠全腦缺血再灌注損傷模型,缺血20min。每組各取6只采用

12、Westernblotting方法檢測EAAT2蛋白表達。另外Sham組、Con組、EA組、AM630+EA組、V+EA組和AM630組各取14只:每組8只再灌注24h神經(jīng)行為學評分后處死小鼠,取腦組織,HE染色,光鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)損傷神經(jīng)元數(shù)目;每組6只,再灌注24h利用免疫熒光法檢測EAAT2和星形膠質細胞特異性標記物-膠質細胞原纖維酸性蛋白(GFAP)共標記的細胞數(shù)目。
　　結果:
　　1.CB2受體拮抗劑AM63

13、0逆轉電針預處理的神經(jīng)保護作用
　　小鼠神經(jīng)行為學評分和CA1區(qū)組織病理學結果:與Sham組比較,Con組小鼠神經(jīng)功能學評分顯著降低(P<0.05),損傷的神經(jīng)元數(shù)目也明顯增多(P<0.05);與Con組比較,EA組和V+EA組小鼠神經(jīng)行為學評分明顯增加(P<0.05),損傷的神經(jīng)元數(shù)目減少(P<0.05);與EA組比較,AM630+EA組小鼠神經(jīng)行為評分降低(P<0.05),損傷神經(jīng)元數(shù)目也明顯增多(P<0.05),而V+EA組

14、這兩項指標沒有差異(P>0.05)。2.CB2受體激動劑AM1241預處理上調腦缺血組織EAAT2蛋白表達,CB2受體拮抗劑AM630逆轉電針預處理的上調EAAT2蛋白表達作用
　　Westernblotting結果:與Sham組比較,Con組EAAT2表達雖有所升高,但沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05);與Con組比較,EA組和V+EA組EAAT2的蛋白表達水平顯著增加(P<0.05);與EA組比較,AM630+EA組EAAT2蛋白

15、表達水平下降(P<0.05),而V+EA組沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。與Con組比較,AM1241組EAAT2表達水平明顯上調(P<0.05),V組沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　3.電針預處理上調腦缺血區(qū)GFAP和EAAT2蛋白表達水平,CB2受體拮抗劑AM630可以逆轉此作用
　　免疫熒光雙標染色結果和Westernblotting結果一致。Sham組和全腦缺血再灌注24h的Con組都表達EAAT2,兩組之間沒

16、有顯著性差異;電針預處理后EAAT2的表達明顯多于Con組,AM630+EA組弱于EA組。Sham組和Con組GFAP強度沒有差異,EA組GFAP明顯強于Con組和AM630+EA組。EAAT2-GFAP雙標記的陽性細胞,同樣也是EA組明顯強于Con組,而AM630+EA組減弱。
　　4.CB1受體激動劑ACEA預處理對全腦缺血EAAT2蛋白表達水平?jīng)]有影響,CB1受體拮抗劑AM251也未逆轉電針預處理引起的EAAT2蛋白表達上調

17、。
　　Westernblotting結果:與Sham組比較,Con組EAAT2表達雖有所升高,但沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05);與Con組比較,EA組和V+EA組EAAT2的蛋白表達水平顯著增加(P<0.05);與EA組比較,AM251+EA組EAAT2蛋白水平雖有所下調,但沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05),V+EA組同樣(P>0.05)。與Con組比較,ACEA組和V組的EAAT2蛋白表達水平?jīng)]有統(tǒng)計學差異(P>0.05)

18、>　　結論:
　　1.神經(jīng)功能學評分和病理組織學結果證明:CB2受體拮抗劑AM630可以逆轉電針預處理的神經(jīng)保護作用;Westernblotting和免疫熒光結果顯示:AM630逆轉了電針預處理引起EAAT2-GFAP陽性細胞數(shù)的增多,CB2受體激動劑AM1241預處理也上調EAAT2蛋白表達水平,提示電針預處理是通過CB2R/EAAT2發(fā)揮神經(jīng)保護作用的。
　　2.CB1受體未參與電針預處理對EAAT2蛋白表達水平的調節(jié)。