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1、目的:研究迷迭香酸對H2O2誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV304凋亡的抑制作用及其機制?! 》椒ǎ翰捎皿w外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV304,首先用H2O2孵育細胞24小時,用流式細胞術(shù)鑒定內(nèi)皮細胞凋亡率;用吖啶橙熒光染色(AO染色)觀察細胞凋亡形態(tài),確定H2O2誘導內(nèi)皮細胞凋亡的最佳濃度。然后按如下分組并處理:(1)正常對照組;(2)H2O2損傷組;(3)迷迭香酸(0.3、1、3、10μmol/L)+H2O2組;(4)維生素E+H
2、2O2組。在迷迭香酸和維生素E預處理該細胞30分鐘后,加入H2O2繼續(xù)培養(yǎng)24小時,應用MTT比色法檢測迷迭香酸對細胞活性的影響;流式細胞儀檢測法和Tunel法檢測迷迭香酸對細胞凋亡率的影響;用Western-blotting檢測不同分組處理24小時細胞中凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白的表達情況和第24小時caspase-3活性?! 〗Y(jié)果:內(nèi)皮細胞用H2O2孵育24小時,低濃度的H2O2(0.1mmol/L,0.2mmol/L)凋
3、亡不明顯,0.5mmol/LH2O2時細胞凋亡明顯,細胞熒光染色出現(xiàn)核濃縮、碎裂等凋亡特征,細胞凋亡率達24.4%;同時伴有Bcl-2蛋白表達減弱,Bax蛋白表達增加,caspase-3蛋白活性增強。而用不同濃度迷迭香酸預先保護可見:(1)MTT法檢測H2O2孵育內(nèi)皮細胞24h,細胞活性由正常時1.00±0.02下降到0.69±0.02。不同濃度的迷迭香酸與H2O2共同孵育內(nèi)皮細胞,呈濃度依賴性的增加內(nèi)皮細胞活性,0.3、1、3、10μ
4、mol/L迷迭香酸使細胞活性分別恢復到0.71±0.07、0.78±0.05、0.84±0.03、0.89±0.03,與H2O2組相比,1、3、10μmol/L迷迭香酸預處理組數(shù)據(jù)有顯著差異(P<0.05);(2)流式細胞儀結(jié)果顯示:0.5mmol/LH2O2明顯誘導細胞凋亡,凋亡率為23.53±3.77%,不同濃度的迷迭香酸使細胞凋亡率呈濃度依賴性下調(diào)(20.01±0.70%、12.47±1.36%、10.4±0.40%、6.57±4
5、.24%,p<0.05);(3)TUNEL法染色細胞鏡下觀察,棕褐色深染的陽性細胞明顯減少,鏡下凋亡細胞計數(shù)與流式細胞計數(shù)一致:H2O20.5mmol/L作用24h后部分細胞核呈棕褐色,凋亡細胞計數(shù)25.5±2.12%,迷迭香酸0.3、1、3、10μmol/L降低細胞凋亡,凋亡率分別為21.3±2.15%、17.5±1.23%、14.5±1.23%、10.5±1.51%,P<0.05。(4)Western-blotting分析細胞中Bc
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