人BTLA的原核表達、多克隆抗體制備及其在肺癌和結直腸癌組織中表達的研究.pdf

1、B、T淋巴細胞弱化因子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)是2003年發(fā)現的CD28家族共抑制受體，主要表達于T、B細胞，在DC、單核細胞及NK細胞上也有表達，能負性調節(jié)T、B細胞的激活與增殖，維持樹突狀細胞在內環(huán)境中的穩(wěn)定，抑制記憶性CD8+T細胞的分化，其在腫瘤患者體內T細胞上高表達，提示在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。為了進一步研究BTLA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，我們擬構建人BTLA(hBTLA)

2、原核表達載體和表達蛋白并制備多克隆抗體，通過免疫組化法檢測肺癌和結直腸癌組織中BTLA蛋白的表達，并分析其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉移中的作用。
　　 [目的]
　　 構建BTLA原核表達載體，誘導表達hBTLA融合蛋白，并經親和層析法純化，將其作為抗原免疫家兔，制備兔抗hBTLA多克隆抗體，純化抗體后，在蛋白水平檢測該分子在肺癌和結直腸癌中的表達情況，并分析BTLA基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　 [方法

3、]
　　 1.構建含hBTLA胞外區(qū)目的基因的T載體克隆及原核細胞表達載體亞克隆，并經酶切、PCR和測序證實。IPFG誘導表達hBTLA融合蛋白，SDS-PAGE電泳鑒定，將重組基因工程菌擴大誘導表達，親和層析法純化誘導的蛋白。
　　 2.將純化的蛋白與弗氏完全佐劑乳化，將其作為抗原免疫家兔，獲得兔抗人免疫血清，經硫酸銨鹽析純化，獲得初步純化的兔抗hBTLA多克隆抗體，通過雙擴散試驗和間接ELISA法檢測多克隆抗體效價和

4、純度，western blot及免疫組化方法初步鑒定其活性。
　　 3.收集手術切除的肺癌和結直腸癌組織標本，應用免疫組織化學方法檢測BTLA蛋白在腫瘤細胞中的表達情況，并分析其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　 4.用商品多抗和自制多抗建立ELISA夾心法，并對方法進行條件優(yōu)化，測定其準確度、精密度、重復性和線性范圍，方法建立后可用于檢測血清中可溶性BTLA的含量。
　　 [結果]
　　 1.獲得hBTL

5、A胞外區(qū)重組基因工程菌的克隆，并表達具有抗原性的BTLA融合蛋白。
　　 2.獲得純化的hBTLA融合蛋白，并用其免疫家兔，得到兔抗hBTLA多克隆抗體。以重組蛋白為抗原，用間接ELISA檢測抗hBTLA抗血清的效價達到1:20000。雙向瓊脂免疫擴散試驗顯示抗hBTLA多克隆抗體與抗原之間形成單一沉淀線，效價達到1:16，表明所制備的多抗效價較高，并具有良好的純度。
　　 3.免疫印跡分析抗hBTLA抗血清在分子量約1

6、5.72KDa處與相應的原核表達蛋白呈現特異性結合條帶，表明所制備的多克隆抗體具有較好的免疫學活性。免疫組織化學染色證明抗體能與腫瘤組織中天然表達的hBTLA蛋白特異性結合，與商品單抗檢測結果一致。
　　 4.22例肺癌標本和19例結直腸癌標本的免疫組化檢測中，BTLA表達的陽性率分別為32％和100％，表達部位位于胞漿和胞膜區(qū)，在肺癌和結直腸癌組織中均有表達，但結直腸癌組織中的表達明顯強于肺癌組織中的表達。
　　 [結

7、論]
　　 成功構建了高效表達重組hBTLA蛋白的原核表達載體，獲得高效穩(wěn)定的重組基因工程大腸桿菌表達菌株，經誘導表達的hBTLA融合蛋白具有免疫原性，將其作為免疫原制備的兔抗hBTLA多克隆抗體能與純化的外源性hBTLA融合蛋白和天然表達的內源性BTLA蛋白發(fā)生結合反應，檢測抗hBTLA多克隆抗體效價、純度、活性均達到預期要求。檢測BTLA在蛋白質水平表達發(fā)現，BTLA在肺癌和結直腸癌組織中均有表達，但結直腸癌組織中的表達明顯