內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在糖尿病腎損害過程中的作用及其機制研究.pdf

1、糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見而嚴重的并發(fā)癥，在DN發(fā)展過程中，腎臟固有細胞過度凋亡導致的細胞增殖與凋亡關系的不平衡是腎功能惡化甚至衰竭的重要機制之一。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是細胞內(nèi)蛋白合成后修飾、折疊的重要場所，對維持細胞正常功能具有重要作用。然而ER對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的環(huán)境變化非常敏感，Ca2+的耗竭、

2、缺血、缺氧、錯誤折疊及未折疊蛋白在腔內(nèi)的聚集等均可干擾ER功能，繼而促發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。ERS激活多種信號途徑，以維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和生存，稱為未折疊蛋白反應(unfolded proteinresponse，UPR)，UPR的重要途徑之一是通過上調(diào)ER中分子伴侶蛋白的表達，增強ER蛋白折疊能力。78kd-糖調(diào)節(jié)蛋白（78-kd glucose-regulatedprot

3、ein，GRP78）是UPR網(wǎng)絡的中心調(diào)節(jié)蛋白，通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激元件PKR、IRE1以及ATF6的結合抑制ERS的激活。因此早期的UPR及時有效的逆轉(zhuǎn)ERS增強細胞的存活能力，是在適度ERS下細胞啟動的一種適應性保護機制。但嚴重而持久的應激超過細胞自身修復能力，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)不能及時恢復，凋亡將是細胞的最終結局。盡管ERS介導的凋亡途徑并沒有完全闡明，但2個標志性蛋白（促凋亡轉(zhuǎn)錄因子GADD153/CHOP的激活和位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的特有的ca

4、spase-12途徑）已經(jīng)被確認參與這個過程，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關性死亡(ER-associated death，ERAD)途徑。
　　 足細胞是腎小球內(nèi)一種獨特的、終末分化的上皮細胞，胞質(zhì)內(nèi)含有較發(fā)達的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體等細胞器，是腎小球濾過屏障的重要組成部分。近年研究顯示以足細胞凋亡為主造成細胞數(shù)目減少在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的凋亡途徑是否與糖尿病腎病中足細胞的凋亡有關尚不完全清楚。
　　 本實

5、驗擬從觀察大鼠糖尿病模型腎組織及高糖培養(yǎng)的小鼠足細胞中凋亡程度，ERS相關蛋白的動態(tài)表達和定位入手，探討ERS在糖尿病腎足細胞凋亡發(fā)生中的可能作用；并研究ERS與傳統(tǒng)線粒體凋亡途徑之間的關系，以便更深入的了解DM腎損傷的潛在分子機制；同時，應用特異的UPR反應誘導劑衣霉素進行預干預實驗，觀察靶向ERS是否能延緩或改善糖尿病腎組織及足細胞損傷的病理進展過程，為疾病治療方案的全新設計提供新思路。
　　 方法：
　　 1.大鼠

6、糖尿病模型腎組織及高糖培養(yǎng)的小鼠足細胞中細胞凋亡及GRP78，GADD153/CHOP和Caspase-12的檢測
　　 體內(nèi)實驗：
　　 雄性Wistar大鼠行右腎切除術后2w，以腹腔單劑量注射鏈脲佐菌素(65mg/kg)制備大鼠糖尿病模型，對照組只注射相當體積的枸櫞酸鹽緩沖液；48h后尾尖取血，血糖儀測定血糖，尿糖試紙測定尿糖，血糖≥16.7mmol/L，尿糖+++～++++者確定為DM模型。實驗期間動物自由進食、飲

7、水，不使用胰島素及其他降糖藥物。對照組及糖尿病組于注射STZ后2w、4w、8w、12w每組取6只大鼠，收集血、尿標本用于生化指標測定；切取腎臟分別置于4％多聚甲醛(0.01mol/L PBS配制)、4％戊二醛及70％乙醇固定，用于光鏡、透射電鏡觀察、免疫組化、TUNEL及流式細胞術檢測；部分腎皮質(zhì)經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱，用于Westernblot檢測。
　　 體外實驗：
　　 1)小鼠足細胞的培養(yǎng)
　　

8、復蘇細胞后，以含10％胎牛血清，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，2-3滴小鼠γ-干擾素的DMEM-F12培養(yǎng)液在細胞培養(yǎng)室5％CO2，33℃CO2培養(yǎng)箱中保持細胞增殖狀態(tài)。待細胞長滿培養(yǎng)瓶瓶底的80％左右即可進行消化傳代；傳代后更換10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素DMEM-F12培養(yǎng)液置入5％CO2，37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天，期間2～3天更換培養(yǎng)液一次，相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，細胞生長速

9、度減慢，細胞體積明顯增大，向四周伸出足突誘導成熟分化后用于實驗。
　　 2)小鼠足細胞分組及相關指標的檢測
　　 將分化成熟的足細胞分成3組：正常糖對照組(NG):D-葡萄糖1g/L；高糖刺激組(HG):D-葡萄糖4.5g/L；高糖+AngⅡ刺激組(HG+AngⅡ):D-葡萄糖4.5g/L+AngⅡ10-8mol/L。分別經(jīng)細胞同步化、分組干預及刺激12、24、48、72h后收集細胞，透射電鏡觀察細胞超微結構改變；TUN

10、EL法及流式細胞術檢測細胞凋亡；免疫細胞化學、Western blot和RT-PCR檢測GRP78、Caspase-12、GADD153/CHOP蛋白及mRNA的表達。
　　 2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激預處理對大鼠糖尿病腎組織及高糖培養(yǎng)的足細胞凋亡中的影響及相關指標的檢測
　　 將雄性Wistar大鼠隨機分為3組：正常對照組(N組)和糖尿病組(DM)和衣霉素處理組(ATM)：分為ATM1組(成膜前1w一次性腹腔注射衣霉素，0.2mg

11、/kg)；ATM2組(成膜1w一次性腹腔注射衣霉素，0.2mg/kg)，于注射STZ后4w及12w處死動物，收集血、尿及腎組織，分別進行血、尿生化指標檢測；透射電鏡觀察腎組織超微結構改變、TUNEL及流式細胞術檢測腎組織細胞凋亡發(fā)生情況；免疫組織化學及Western blot檢測腎皮質(zhì)中GRP78、Caspase-12、GADD153/CHOP蛋白表達變化。
　　 體外實驗：
　　 將分化成熟的小鼠足細胞分成3組：正常糖

12、對照組(NG)：D-葡萄糖1g/L;高糖刺激組(HG)：D-葡萄糖4.5g/L；衣霉素干預組(CTM)：衣霉素0.1μg/ml+D-葡萄糖4.5g/L，分別經(jīng)細胞同步化、分組干預及刺激24、72h收集細胞，透射電鏡觀察超微結構變化、免疫細胞化學、westernblot檢測GRP78、Caspase-12、GADD153/CHOP蛋白的表達。
　　 3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激預處理劑衣霉素對高糖培養(yǎng)的足細胞中傳統(tǒng)線粒體凋亡途徑的影響及相關指標

13、的檢測
　　 將分化成熟的小鼠足細胞分成3組：正常糖對照組(NG)：D-葡萄糖1g/L、高糖刺激組(HG):D-葡萄糖4.5g/L和衣霉素干預組(CTM):衣霉素0.1μg/ml+D-葡萄糖4.5g/L。分別經(jīng)細胞同步化、分組干預及刺激72h后收集細胞。流式細胞術檢測線粒體跨膜電位：免疫細胞化學和Western blot檢測足細胞中Caspase-3蛋白的表達變化；Western blot檢測Cytochrome C蛋白的表達變

14、化。
　　 結果：
　　 1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導糖尿病大鼠腎組織固有細胞和高糖培養(yǎng)的小鼠足細胞的凋亡
　　 體內(nèi)試驗：
　　 ①光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：糖尿病組腎小球體積增大，系膜基質(zhì)增多，部分腎小管上皮細胞出現(xiàn)空泡變性；②透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：糖尿病組腎小球基底膜不規(guī)則增厚，足細胞部分足突融合，近曲小管上皮細胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的空泡。腎小管上皮細胞及足細胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可見顆粒融合及脫顆?，F(xiàn)象，線粒體部分嵴消失，嵴膜明顯融

15、合；③TUNEL結果顯示，正常對照組鮮有凋亡細胞，糖尿病組細胞凋亡數(shù)自2w起即明顯增多，主要見于腎皮質(zhì)腎小管上皮細胞，尤以皮髓質(zhì)交界處多見，4w起腎小球內(nèi)可見凋亡細胞；流式細胞術結果顯示糖尿病腎組織中細胞凋亡率較對照組明顯升高，且呈時間依賴性；④免疫組織化學結果：GRP78在正常對照組呈弱表達，主要定位于遠端小管和集合管上皮細胞胞漿內(nèi)，與之相比，糖尿病組GRP78的表達明顯增強，尤以近曲小管胞漿最為顯著，4周起，部分腎小球內(nèi)細胞胞漿也呈

16、陽性表達，之后表達逐漸減弱；Caspase-12正常對照組表達較弱，主要位于腎小管上皮細胞胞漿內(nèi)，糖尿病組表達明顯增強，近曲小管及小球固有細胞的胞漿內(nèi)均可見陽性表達；GADD153/CHOP正常組表達主要位于小管上皮的胞漿內(nèi)，個別細胞核呈陽性，糖尿病組腎小管、腎小球固有細胞胞漿胞核均有表達，細胞核陽性表達的細胞主要位于近端小管上皮細胞及部分腎小球，尤其在皮髓質(zhì)交界的部位，較正常對照組明顯增多；⑤Western blot結果：糖尿病組GR

17、P78自2w起表達即高于對照組，4w表達達高峰，之后隨時間延長表達逐漸下降，12w基本降至正常水平；Caspase-12自4w開始表達高于對照組，并隨時間延長表達逐漸增高；GADD153/CHOP核蛋白在糖尿病組各個時間點的表達均高于對照組，8w達高峰，12w表達略下降。
　　 體外實驗：
　　 ①透射電鏡結果顯示，正常足細胞結構清晰，可見少許微絨毛、細小突起。高糖刺激下，足細胞絨毛及突起增多，細胞內(nèi)可見大量空泡，線粒體

18、及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見形態(tài)學改變，高糖+AngⅡ刺激組足細胞形態(tài)學改變與高糖組大致相同；②流式細胞術及TUNEL法結果均顯示：高糖刺激組細胞凋亡數(shù)明顯高于對照組，而高糖+AngⅡ刺激組細胞凋亡率較高糖刺激組進一步升高，呈時間依賴性；③免疫細胞化學結果：對照組GRP78、GADD153/CHOP、Caspase-12均有少量陽性表達，高糖刺激后，足細胞內(nèi)這三種蛋白陽性表達均明顯增強，高糖+AngⅡ刺激組較高糖組表達進一步增高；④Western bl

19、ot結果：高糖刺激組GRP78、Caspase-12、GADD153/CHOP表達較正常對照組增高，GRP78在24h達高峰，之后呈下降趨勢，72h基本降至正常水平；Caspase-12隨時間的延長表達逐漸增高，GADD153/CHOP核蛋白表達于48h最高，72h表達略下降。高糖+AngⅡ刺激組這三者表達較高糖組進一步升高，趨勢大致相同；⑤RT-PCR結果：高糖刺激組GRP78、Caspase-12、GADD153/CHOP的mRNA

20、水平表達較正常對照組增高，趨勢與Western blot結果大致相同，高糖+AngⅡ刺激組這三者表達較高糖組進一步升高。
　　 2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激預處理劑衣霉素對大鼠糖尿病腎組織及高糖培養(yǎng)的足細胞凋亡及相關指標的影響
　　 適宜劑量UPR誘導劑衣霉素預處理通過上調(diào)了UPR中心調(diào)解蛋白GRP78的表達，抑制了ERS相關凋亡信號途徑GADD153/CHOP、Caspase-12的激活，減少細胞的凋亡率，改善糖尿病大鼠腎損害程度及

21、足細胞的病理形態(tài)學變化
　　 體內(nèi)實驗：①光鏡下觀察，ATM1和ATM2組組腎組織病理變化于12w時較糖尿病組有所改善；②透射電鏡觀察，糖尿病組改變同前所述，ATM1組和ATM2組4w時基底膜輕度增厚，足突個別融合，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可見顆粒融合及脫顆粒現(xiàn)象，12w時，基底膜及足細胞足突病變較糖尿病組明顯減輕，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)也有明顯改善，線粒體部分嵴膜融合，模糊不清；③流式細胞術及TUNEL法檢測結果均顯示：ATM1組和ATM2組凋亡細胞數(shù)

22、或凋亡率明顯低于糖尿病組，但仍高于正常對照組。④免疫組織化學結果：ATM1組和ATM2組GRP78的表達較糖尿病組進一步增高，GADD153/CHOP、Caspase-12的表達于4w時與糖尿病組相比無明顯差異，12w時，表達較糖尿病組有所下降，但仍高于正常對照組；⑤Western blot結果：ATM1組和ATM2組GRP78的表達較糖尿病組進一步增高，GADD153/CHOP、Caspase-12的表達于4w時與糖尿病組相比差異無統(tǒng)

23、計學意義，12w時，表達較糖尿病組有所下降，但仍高于正常對照組。
　　 體外實驗：
　　 ①透射電鏡結果顯示：CTM2組足細胞形態(tài)學改變較糖尿病組有所減輕；②流式細胞術及TUNEL法結果顯示：CTM2組凋亡細胞數(shù)明顯低于高糖刺激組，但仍高于正常對照組，CTM1組凋亡率與高糖刺激組相比無統(tǒng)計學意義，CTM3組凋亡細胞數(shù)較高糖刺激組大大增高；③免疫組織化學結果：CTM2組GRP78表達較高糖組有所增加，Caspase-12、

24、GADD153/CHOP表達較高糖組減弱，但均高于正常糖對照組；④Western blot結果：CTM2組GRP78于24h表達最強，之后呈下降趨勢，但表達始終高于高糖刺激組。Caspase-12、GADD153/CHOP72h時較高糖刺激組表達明顯減弱。
　　 3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激預處理劑衣霉素對高糖培養(yǎng)的足細胞傳統(tǒng)線粒體凋亡途徑相關指標的影響
　　 ①足細胞線粒體膜電位（mitochondrial tranmembrane

25、 pitentials，ΔΨm）的改變：高糖刺激組較正常對照組ΔΨm明顯下降，CTM刺激組較高糖對照組明顯升高，但較正常對照組降低。②免疫組化結果：對照組足細胞Caspase-3有少量陽性表達，高糖刺激后，細胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達明顯增強，CTM刺激組蛋白表達較高糖組顯著降低。③Western blot結果：高糖刺激組Cytochrome C、Caspase-3表達較正常對照組增高，CTM刺激組蛋白表達較高糖組顯著降低。

26、　　 結論：
　　 1.糖尿病大鼠腎損害及高糖刺激對足細胞的損害過程中誘導了ERS，其相關凋亡途徑參與了腎臟固有細胞凋亡，并在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　 2.適宜劑量的UPR誘導劑衣霉素預處理糖尿病大鼠及高糖培養(yǎng)的足細胞，顯著減少了細胞的凋亡率，增強了細胞的存活能力，對組織細胞具有保護作用。但UPR是雙刃劍，衣霉素的這種保護作用與它的濃度有關，過強的激活ERS，最終會導致細胞的損害直至凋亡。
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