miR--503在前列腺癌的抑癌作用及其機制研究.pdf

1、背景:前列腺癌在目前男性腫瘤發(fā)病率里居第二位，據(jù)統(tǒng)計，美國在2012年新發(fā)病例241740例，死亡病例28170例。我國近年來隨著PSA篩查的開展，其發(fā)病率也逐年上升。根據(jù)目前人們對前列腺癌的發(fā)病原因和進展機制研究發(fā)現(xiàn)，除了常見的遺傳學因素，許多重要的分子事件是導致腫瘤細胞形成、進展和轉移的深層次原因。關于RNA的研究近年來受到了廣泛的關注，甚至被評為“十大科技突破之一”，而其中最引人注意的是microRNA(miRNA)。miRNA是

2、一類小分子非編碼RNA，作為一種重要的基因調控物質，調控大約30％人類基因的轉錄，控制著細胞的分化、增殖和程序性細胞死亡等多種重要生理過程。大量證據(jù)表明，超過50％的人類miRNA基因與癌癥有關，其在多個不同類型的腫瘤及疾病中異常表達，且與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關。
　　目的:本研究首先通過測定miR-503在前列腺癌PC-3及DU-145細胞株中的表達情況，并通過一系列功能實驗研究了miR-503在前列腺癌細胞中的生物學功能，然后

3、根據(jù)生物信息學知識，對miR-503潛在的靶點進行預測并加以驗證，并通過靶點分子的沉默和過表達實驗，證實miR-503對靶點的調控意義。
　　方法:1.檢測前列腺癌細胞株中miR-503的表達量，并與前列腺正常上皮細胞株中miR-503的表達量進行比較;并檢測CCND1在前列腺癌細胞及組織芯片中的表達情況，檢測TLN1在前列腺癌細胞中的表達情況，證明CCND1及TLN1在前列腺癌細胞與正常細胞之間存在差異表達;
　　2.通過

4、體外轉染miR-503 mimic的方式使細胞呈現(xiàn)miR-503過表達趨勢以此進行獲得性功能實驗。在此基礎上，通過細胞活力分析實驗(CCK-8)、平板克隆形成、流式細胞術以及Transwell實驗，研究miR-503與的哪些細胞功能有關;
　　3.使用在線生物信息學工具，預測并挑選潛在的miR-503靶基因，并通過構建熒光素酶報告系統(tǒng)對這些靶點進行驗證，并利用Western Blot、RNA干擾和質粒過表達等實驗進一步證實靶向調控

5、關系。
　　結果:1.與前列腺正常上皮細胞株RWPE-1相比，在前列腺癌PC-3和DU-145細胞株中，miR-503均呈低表達，而CCND1及TLN1呈高表達。在組織芯片中，CCND1在癌組織較癌旁組織呈高表達;
　　2.通過對PC-3和DU-145細胞轉染miR-503 mimic來過表達細胞中的miR-503，我們觀察到細胞的存活率明顯受到抑制，用50nM的mimic處理后，PC-3在處理48小時及72小時后抑制率分別

6、達到了26％和36％(p＜0.05)，而DU-145的抑制率在處理48小時及72小時后分別達到29％和38％(p＜0.05)。平板克隆形成實驗顯示，miR-503過表達使PC-3細胞克隆形成率下降了36％，使DU-145細胞克隆形成率下降了19％。流式細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)miR-503 mimic處理可以誘導PC-3和DU-145細胞發(fā)生G1期阻滯，50nM miR-503 mimic作用48小時后，PC-3和DU-145細胞G1期的比例分

7、別增加13％和12％，而流式細胞凋亡檢測提示miR-503過表達并不能誘導細胞凋亡。此外， Transwell小室實驗則提示miR-503能顯著地影響細胞的侵襲和遷移行為。
　　3.根據(jù)生物信息學知識，我們預測miR-503的可能靶基因為CCND1、TLN1。熒光素酶雙報告系統(tǒng)和western實驗證實CCND1是miR-503與周期相關的直接作用靶點，而TLN1是與侵襲遷移功能相關的直接作用靶點。對CCND1實施特異性沉默和過表達

8、進一步證實了其在miR-503調控細胞周期過程中的作用;對TLN1實施特異性沉默進一步驗證了其在miR-503調控細胞侵襲遷移功能中的作用。
　　結論:1.miR-503在前列腺癌細胞中呈低表達，而CCND1、TLN1則呈高表達。
　　2.過表達miR-503使得前列腺癌細胞PC-3和DU-145發(fā)生細胞周期阻滯及增殖顯著抑制，并削弱了細胞的克隆形成能力。同時，還抑制了細胞的侵襲及遷移功能。
　　3.CCND1、TLN