miR-375及MTDH在前列腺癌細胞中的功能研究.pdf

1、第一章:miR-375及MTDH在前列腺癌組織的表達及臨床意義
　　目的:研究miR-375及MTDH在前列腺癌中的表達及臨床意義。
　　方法:采用實時定量PCR技術檢測10例PCa及癌旁非腫瘤組織中miR-375及MTDH的表達情況，研究其與PCa病理分期、分級之間的關系。
　　結果:實時定量PCR發(fā)現，10例PCa患者與配對的癌旁非腫瘤組織相比，miR-375在PCa中的表達下調，MTDH在PCa中的表達上調，兩者

2、表達均有顯著統(tǒng)計學差異(p＜0.01)。根據病理分期分為T1-T2和T3a組，兩組的miR-375及MTDH表達均有顯著統(tǒng)計學差異(p＜0.05);根據病理分級分為G1-G2和G3-G4組，兩組miR-375表達相比無顯著差異(p＞0.05)，MTDH表達相比有顯著差異(p＜0.05)。miR-375和MTDH在前列腺癌組織中表達存在負相關，相關系數r為-0.79(p＜0.01)。
　　結論:
　　1、PCa中miR-375

3、的表達水平較癌旁非腫瘤組織明顯下調，MTDH在PCa中的表達上調，提示miR-375及MTDH表達可能與PCa發(fā)生發(fā)展相關。
　　2、miR-375及MTDH表達與PCa病理分期相關，其中MTDH還與PCa病理分級相關，提示miR-375及MTDH表達可能與PCa預后相關。
　　3、miR-375和MTDH在前列腺癌組織中表達存在負相關，提示在PCa中miR-375與MTDH之間可能存在調控關系。
　　第二章:miR-

4、375及MTDH在不同前列腺癌細胞株中的表達
　　目的:探討miR-375及MTDH在PC3、DU145、LNCap前列腺癌細胞株中的表達，選擇miR-375表達相對較低、MTDH表達相對較高的細胞株進行下一步實驗。
　　方法:用實時定量PCR技術檢測PC3、DU145、LNCap前列腺癌細胞株中miR-375及MTDH的表達情況，Western Bolt檢測PC3、DU145、LNCap前列腺癌細胞株中MTDH蛋白的表達情

5、況。
　　結果:實時定量PCR發(fā)現，DU145和LNCap細胞株miR-375的相對表達量均顯著低于PC3(p＜0.01)，MTDH的相對表達量均顯著高于PC3(p＜0.01); Western Bolt檢測結果顯示DU145和LNCap細胞株MTDH蛋白的相對表達量均高于PC3(p＜0.01)。miR-375及MTDH的相對表達量DU145和LNCap兩者相比均無顯著差異(p＞0.05)。在LNCap細胞株中miR-375表達相

6、對較低、MTDH表達相對較高。
　　結論:
　　1、miR-375及MTDH的表達在前列腺癌不同細胞系表達并未體現出明顯與前列腺癌細胞惡性程度相關。
　　2、LNCap細胞株中miR-375表達相對較低、MTDH表達相對較高，選擇LNCap細胞株進行下一步實驗。
　　第三章:miR-375與MTDH的調控關系研究
　　目的:探討在前列腺癌中miR-375與MTDH之間是否存在調控關系。
　　方法:采用

7、LipofectamineTM2000轉染空載體及miR-375模擬物片段于LNCap細胞株中，實時定量PCR檢測LNCap細胞株中miR-375及MTDHmRNA的表達情況，Western Bolt檢測LNCap細胞株中MTDH蛋白的表達情況。
　　結果:在LNCap中，轉染空載體的陰性對照(NC)組miR-375的相對表達量低于有效轉染組，有顯著差異(p＜0.01); NC組MTDH的相對表達量高于有效轉染組，有顯著差異(p＜

8、0.01); NC組MTDH蛋白的相對表達量高于有效轉染組，有顯著差異(p＜0.01)。
　　結論:
　　1、miR-375模擬物片段能有效的轉染于前列腺癌細胞中，上調前列腺癌細胞中miR-375的表達。
　　2、在前列腺癌細胞中，上調miR-375后能有效下調MTDH表達。
　　第四章:miR-375及MTDH對前列腺癌細胞株LNCap細胞生物學行為的影響
　　目的:探討miR-375對前列腺癌細胞株LN

9、Cap細胞增殖、凋亡及侵襲能力等生物學行為的影響。
　　方法:
　　1、構建miR-375模擬物片段及MTDH干預序列，并轉染到LNCap細胞中。
　　2、實時定量PCR檢測LNCap細胞株中miR-375及MTDH的表達，Western Bolt檢測LNCap細胞株中MTDH蛋白及PI3K/Akt通路相關蛋白的表達。
　　3、MTT法檢測細胞的存活率，AV/PI雙標法FCM檢測細胞的凋亡情況，細胞侵襲實驗觀察細

10、胞浸襲能力。
　　4、MTT法檢測順鉑毒性預實驗，選擇最適藥物濃度。
　　5、LNCap細胞分六組:A前列腺癌細胞培養(yǎng)組;B前列腺癌細胞+miR-375模擬物轉染組;C前列腺癌細胞+miR-375模擬物轉染組+順鉑藥物;D前列腺癌細胞+順鉑藥物;E前列腺癌細胞+MTDH基因干預組;F前列腺癌細胞+ MTDH基因干預+順鉑藥物。檢測每組miR-375與MTDH的表達、細胞存活率、細胞凋亡及細胞侵襲等生物學特征。
　　結果

11、:
　　1、構建miR-375模擬物片段及MTDH干預序列，并轉染到LNCap細胞中，細胞的轉染效率達到80％以上。
　　2、順鉑濃度為1ug/ml時，作用24h后腫瘤細胞存活率為83％，選擇此濃度作為下一步實驗的作用濃度。
　　3、B、C、D、E、F組與A組比較，細胞存活率下降，有顯著差異(p＜0.05)，其中C、F組與A組比較，細胞存活率明顯下降，有顯著差異(p＜0.01);C、F組與D組比較，細胞存活率明顯下降，

12、有顯著差異(p＜0.01);B、C組分別與E、F比較，細胞存活率降低，有顯著差異(p＜0.05)。
　　4、與A組比較，其它各組凋亡率增高，有顯著差異(p＜0.01)，其中C、F組與A組比較，細胞凋亡率增高明顯，有顯著差異(p＜0.01);C、F組與D組比較，細胞凋亡率增高明顯，有顯著差異(p＜0.01);B、C組分別與E、F比較，細胞凋亡率增高明顯，有顯著差異(p＜0.05)。
　　5、與A組比較，其它各組細胞數量下降，有

13、顯著差異(p＜0.01)，其中C、F組與A組比較，細胞侵襲數量下降明顯，有顯著差異(p＜0.01);C、F組與D組比較，細胞侵襲數量下降明顯，有顯著差異(p＜0.01);B、C組分別與E、F比較，細胞侵襲數量下降明顯，有顯著差異(p＜0.05)。
　　6、A組的MTDH、p-PI3K-p85、Akt及p-Akt表達高于E組，差異有顯著性(p＜0.01)。
　　結論:
　　1、miR-375高表達及MTDH低表達抑制了前