新型腺相關病毒載體及應用研究.pdf

1、腺相關病毒載體在基因治療基礎研究和臨床試驗中得到越來越多的應用。近年來，多種血清型以及外殼改造的AAV載體的發(fā)展更拓寬了其應用價值和范圍。
　　本研究第一部分建立了以攜帶rep和cap基因的重組單純皰疹病毒作為輔助病毒的、多種血清型AAV載體的生產(chǎn)系統(tǒng)和方法，并成功地制備了攜帶報告基因的AAV1、AAV2、AAV5/5、AAV2/5m、AAV2/8m、AAV8等6種重組病毒，用點雜交方法測定了這些病毒的滴度，用SDS-PAGE方法

2、分析了它們的外殼蛋白組成和病毒純度。這部分研究為AAV病毒在基因治療等方面的應用提供了新的選擇，也是為本文第二、三部分工作做準備。
　　本研究第二部分創(chuàng)建了一種AAV載體“反向感染”陣列(AAV ReverseInfection Array，AAV RU array)方法，即將攜帶了報告基因或外源基因的rAAV病毒有序排列于96孔細胞培養(yǎng)板中形成一種陣列并晾干保存。該方法的意義在于可以簡單方便地實現(xiàn)高通量的體外轉(zhuǎn)導，可用于在體外比

3、較不同血清型AAV對細胞的轉(zhuǎn)導效率、攜帶生物傳感器用于檢測細胞miRNA活性譜等方面的研究。
　　為了探索AAV反向感染的可行性，我們首先研究了96孔培養(yǎng)板上每孔AAV病毒的包被量以及加入的細胞數(shù)量范圍：其次篩選和優(yōu)化了AAV載體包被于細胞培養(yǎng)板上晾干保存的溶液配方，并評價了培養(yǎng)板上包被的AAV載體的熱穩(wěn)定性。結果顯示，用適當?shù)木彌_液可以將AAV病毒包被在細胞培養(yǎng)板上并且晾干而不失去活性，并且可以在4。C長期保存。之后，我們用AA

4、V砌array方法比較了不同血清型或外殼嵌合型AAV載體對多種細胞的轉(zhuǎn)導效率。將表達EGFP基因的6種AAV載體(包括AAVl、AAV2、AAV5/5、AAV2/5m、.AAV2/8m、AAV8載體)用AAV RI array方法體外感染16種細胞，其中包括12種貼壁培養(yǎng)的細胞BHK21，HEK293，BEAS-2BS，C2Cl2，L02，Huh7，HepG2，Hepal-6，L/S-39，CT-26，A549，HeLaS3和4種懸浮培

5、養(yǎng)的細胞U937、K562、SP2/0、A20細胞。結果表明，AAV載體在對體外培養(yǎng)的不同細胞的感染效率有很大差異，BHK21、HEK293、U937、BEAS-2BS細胞的感染效率高，而CT-26、SP2/0、A20和L/S-39對各型AAV載體均不敏感；對于同一種細胞，不同型AAV載體的感染效率明顯不同，一般是AAV2>>AAV1>>其它AAV載體；HeLaS3細胞對AAV1的感染效率則高于AAV2；加丁酸鈉可以明顯提高AAV載體介

6、導的基因表達，尤其是對于AAV2載體的增強效果最顯著，其次是AAV1；AAV8載體對體外培養(yǎng)的各種細胞的感染效率都遠不如AAV2和AAV1。
　　在上述工作基礎上，我們嘗試將AAV RI Array方法應用于細胞miRNA活性的檢測，建立了一種新的細胞中miRNA活性譜檢測方法。構建了一系列由AAV2載體攜帶的miRNA活性檢測傳感器(Asensor)，并利用AAV RI Array方法將其制備成Asensor陣列，并用其檢測了A

7、549、Huh7、HEK293、HeLaS3、K562和BEAS-2BS等細胞株中miRNA的活性譜。初步研究結果令人鼓舞，顯示了這種方法良好的的可行性和應用潛力。
　　本研究第三部分嘗試用AAV8為載體研制HBV小鼠模型。制備了一種攜帶1.3拷貝HBV(ayw亞型)基因組的重組AAV8病毒rAAV8-HBV1.3，經(jīng)尾靜脈注射到3只C57BL/6小鼠體內(nèi)。一周開始在血液中檢測到HBsAg和HBeAg的表達，并持續(xù)至10周均為陽性

8、。其中HBsAg的表達水平經(jīng)歷了一個上升-下降-再上升的過程(注射后第4周為最低)。而HBeAg表達水平則比較穩(wěn)定持續(xù)。10周后處死動物，取血和肝組織進行檢測。肝臟組織切片HE染色進行病理分析，未見明顯的炎細胞浸潤及組織結構異常；免疫組化分析顯示3只小鼠肝臟中HBsAg和HBeAg均為陽性。提取肝組織基因組DNA，用PCR方法檢測HBV S基因，結果3只小鼠均為陽性；進一步用熒光定量PCR法試劑盒(深圳匹基公司)檢測血清和肝臟組織中的H

9、BV DNA，3只小鼠血清中的HBV DNA拷貝數(shù)分別為4.2×103、3.6×103、2.5×103copies/mL；肝臟中分別為8.0×106、5.7×106、2.6×106 copies/g肝組織。為了進一步了解所導入的HBV DNA在肝臟內(nèi)的復制是按AAV病毒復制方式還是按HBV病毒方式進行的，我們在1.3拷貝的HBV非重復區(qū)設計了一對特異性PCR引物，對肝臟組織基因組DNA進行擴增。結果提示，肝臟中的確存在HBV病毒的復制方

10、式。之后，我們初步比較了2種不同品系的小鼠(C57BL/6與Balb/c)注射rAAV8-HBV1.3制備HBV動物模型的效果。結果顯示，C57BL/6小鼠能持續(xù)表達HBsAg和HBeAg24周以上，而Balb/c小鼠則表現(xiàn)為持續(xù)表達HBeAg，但HBsAg僅在前2周陽性，之后轉(zhuǎn)為陰性，同時HBsAb出現(xiàn)陽性。這些結果提示，C57BL/6小鼠比較容易形成對HBV病毒基因表達的耐受；而Balb/c可能更適合制備慢性乙型肝炎模型。本研究為下