攜帶趨化因子CCL5的Ad5-11嵌合型增殖腺病毒對肝癌殺傷作用的研究.pdf

1、增殖型腺病毒又稱條件復制型腺病毒或溶瘤病毒，可利用腫瘤細胞與正常組織細胞間結構及代謝途徑的差異，靶向性地在腫瘤細胞內(nèi)復制增殖，最終裂解腫瘤細胞，同時能長效表達抗腫瘤的外源基因[1]。常用的5型增殖型腺病毒具有可復制、體積小、彌散能力強等優(yōu)點，但也存在感染效率不高及毒副作用強等問題。人11型腺病毒(Ad11)屬于B2亞群，與傳統(tǒng)的5型等C組腺病毒載體相比有許多優(yōu)點：血清中的中和抗體陽性率較低；與5型腺病毒(Ad5)無免疫交叉反應；感染細胞

2、不依賴CAR受體，能夠高效感染多種重要的干細胞及原代腫瘤細胞；肝臟毒性低，免疫副作用小等[2-3]。用11血清型腺病毒纖毛蛋白的knob和shaft替換傳統(tǒng)5型腺病毒載體纖毛蛋白的knob和shaft，構建成的具有嵌合型纖毛蛋白的Ad5/F11腺病毒載體，繼承了Ad11的感染特性，能有效轉(zhuǎn)導CAR表達不足的多種重要靶細胞，尤其是對腫瘤細胞及造血干細胞、間充質(zhì)干細胞等有較高的感染效率[2-3]。
　　 趨化因子是一類在細胞的生理過

3、程中發(fā)揮著重要作用的細胞因子樣蛋白質(zhì)，可趨化白細胞和免疫細胞向組織浸潤[4-5]。趨化因子在腫瘤生物學中具有較復雜的作用和重要意義，將趨化因子導入腫瘤組織，能強化宿主抗腫瘤免疫反應[6-7]。NK細胞是一種大顆粒淋巴細胞，英文全稱為”natura.kille.cell”，也稱作”自然殺傷細胞”，它屬于一種能直接殺傷靶細胞效應的特殊的淋巴細胞系，具有抗腫瘤抗感染免疫調(diào)節(jié)的功能，且表現(xiàn)為速發(fā)效應。趨化因子借助NK細胞參與抗腫瘤免疫的環(huán)節(jié)大致

4、為：吸引外周血NK細胞(該部位趨化因子濃度低)浸潤腫瘤部位，促進NK細胞與腫瘤細胞結合，這種結合使得大量趨化因子瞬間釋放出來，形成局部高濃度區(qū)域，不僅增強了NK的溶細胞作用，還可趨化大量NK細胞、T細胞、單核細胞不斷進入腫瘤局部；NK細胞分泌的多種無ELR的趨化因子破壞了腫瘤的微血管系統(tǒng)，導致其他效應細胞和細胞毒分子滲出到腫瘤組織，引起腫瘤的出血壞死[8]。
　　 趨化因子CCL5也稱為RANTES，是受激活調(diào)節(jié)正常T細胞表達和

5、分泌因子(regulate.upo.activatio.norma cel.expresse.an.secrete.factor.RANTES)，是趨化性細胞因子CC亞族成員(CCL5)。其來源廣泛，多數(shù)組織在炎性因子IL-1β或TNF-α的刺激下可釋放RANTES，RANTES由CD8+T細胞、上皮細胞、成纖維細胞和血小板分泌。病毒感染可引起某些細胞RANTES的表達升高，如呼吸道合胞病毒感染可引起人鼻粘膜及腺樣上皮細胞RANTES的

6、表達升高；流感病毒感染可誘導人支氣管組織和鼻息肉的上皮細胞表達RANTES；某些腫瘤細胞在一定的條件下也可表達RANTES，如傷寒沙門氏菌感染或細胞因子可刺激HT-29、Caco-2細胞表達RANTES。RANTES對多種白細胞如T細胞、單核細胞、自然殺傷細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞具有趨化或刺激作用。其特異性受體屬7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR類)，包括CCR1、CCR3、CCR4和CCR5?，F(xiàn)認為，RANTES對白細胞的趨化作

7、用依賴于RANTES與GAG的結合，GAG位于細胞外基質(zhì)和內(nèi)皮細胞表面[9]。因此RANTES的聚集能增強其趨化作用，可能是通過提高局部的RANTES濃度，使得吸引細胞所經(jīng)路徑形成RANTES的濃度梯度。近年來，RANTES基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中的作用被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[10]，認為該基因在腫瘤免疫治療方面具有潛力，逐漸成為新的研究熱點。.基于以上研究根據(jù)，本研究構建了攜帶ccl5基因以及氧依賴性蛋白降解結構域基因odd的Ad5/F11

8、嵌合型增殖腺病毒SG511-CCL5-ODD，希望利用Ad5/F11嵌合型增殖腺病毒更強的腫瘤感染能力與殺傷作用，在腫瘤內(nèi)部缺氧環(huán)境下特異性表達CCL5，提高攜帶ccl5基因的腺病毒的腫瘤殺傷能力。不僅如此，趨化因子CCL5也將趨化更多的淋巴細胞，尤其是T細胞進行細胞殺傷作用。并且我們將在體內(nèi)實驗中驗證趨化因子在腫瘤部位表達后對NK細胞的趨化能力，誘導更多的NK細胞靶向殺傷腫瘤細胞，運用機體自身的免疫反應對腫瘤進行消除。
　　

9、.Ad5/F11嵌合型增殖腺病毒SG511-CCL5-ODD的構建
　　 在前期實驗中，已經(jīng)通過分子生物學技術將Ad.fiber的knob和shaft替換為Adl.fiber的knob和shaft，構建嵌合型Ad5/F11腺病毒骨架質(zhì)粒SG511。將攜帶ccl5基因及缺氧調(diào)控基因ODD的穿梭質(zhì)粒pPE3-F11B-CCL5-ODD與5型腺病毒骨架質(zhì)粒pSG502(CNHK500病毒的穿梭質(zhì)粒)通過Lipofectamin.200

10、0共轉(zhuǎn)染至293細胞。共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過三次病毒空斑純化，提取腺病毒DNA并應用PCR進行鑒定，經(jīng)鑒定正確的腺病毒命名為SG511-CCL5-ODD；同時重組出Ad5/F11嵌合型非增殖腺病毒AD5/11-CCL5-ODD與Ad5/F11嵌合型增殖腺病毒SG511-CCL5-ODD。將重組出的病毒在293細胞中反復大量擴增，通過氯化銫密度梯度離心法進行純化，并用TCID50法測得重組腺病毒SG511-CCL5-ODD的

11、滴度達到2.79×1010pf./ml。
　　 .腺病毒SG511-CCL5-ODD治療肝癌的體外實驗
　　 增殖實驗表明SG511-CCL5-ODD能在肝癌細胞HepG2與Hep3B內(nèi)大量復制，在正常細胞內(nèi)復制擴增卻很弱；通過ELISA實驗確定SG511-CCL5-ODD能高效感染肝癌細胞HepG2與Hep3B并在缺氧條件下大量表達CCL5；將SG511-CCL5-ODD感染后的Hep3B細胞上清對NK92細胞進行趨化

12、實驗證實CCL5蛋白的活性，并證實CCL5對NK92細胞具有良好的趨化效應。將增殖腺病毒SG511-CCL5-ODD、非增殖型腺病毒AD5/11-CCL5-ODD感染細胞，通過MTT實驗評價細胞存活率并進行病毒的肝癌殺傷作用比較。一系列體外實驗結果表明SG511-CCL5-ODD對肝癌有很強的感染能力與腫瘤殺傷作用，安全性良好。
　　 .腺病毒SG511-CCL5-ODD治療肝癌的體內(nèi)實驗
　　 將BALB/c裸鼠皮下注

13、射SMMC-7721細胞懸液，建立肝癌動物模型。將動物隨機分為4組，分別瘤內(nèi)注射PBS、SG511-CCL5-ODD、AD5/11-CCL5-ODD、SG511治療。自接種之日起，定期測量腫瘤體積；4周后將腫瘤組織取出，固定后制成石蠟病理切片。將腫瘤組織切片進行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察組織病變情況。體內(nèi)實驗結果說明，攜帶ccl5基因的Ad5/F11嵌合型增殖腺病毒SG511-CCL5-ODD具有良好的體內(nèi)抑瘤作用，能抑制腫瘤的發(fā)生