Der p2重組BCG疫苗調控哮喘小鼠DC表型及功能的研究.pdf

1、目前認為，體內Th1/Th2失衡，Th2優(yōu)勢是哮喘重要的免疫學發(fā)病機制之一。對過敏原的免疫不耐受性在哮喘發(fā)病機制中的作用是近年研究的熱點問題。樹突狀細胞(Dendriticcell,DC)是體內高效抗原提呈細胞(antigenpresentationcell,APC)，具有高效誘導T細胞分化和增殖以及調節(jié)免疫耐受等能力。DC攝取抗原并活化后，其表面MHC-II、共刺激分子和各類趨化因子表達水平增高，隨后通過其表面的MHC-抗原肽復合物與

2、T細胞表面受體相互結合，與共刺激分子共同作用，在特殊的細胞因子環(huán)境下誘導初始T細胞活化并向不同T細胞亞群分化、增殖。隨著研究的深入，越來越多的DC亞群被發(fā)現。然而，不同的DC亞群對各類T細胞的活化、分化和增殖能力的影響不盡相同。因此調控DC的功能及表型有可能成為治療哮喘新的生物學靶點。已有部分實驗表明通過基因轉染、藥物干預等方法影響DC的表型和功能可以有效抑制哮喘的病理表現。但這些方法都存在著安全性和體內可操作性等問題。因此，對于如何安

3、全、有效地調節(jié)DC的表型和功能，恢復哮喘患者體內各類T細胞亞群的平衡值得我們深入研究。
　　BCG疫苗是結核分枝桿菌減毒疫苗，應用范圍廣泛，其安全性和免疫穩(wěn)定性已得到肯定。流行病學證據表明兒童生長早期接種BCG與其成年后發(fā)生過敏性疾病幾率呈負相關。在哮喘發(fā)病過程中，T細胞發(fā)揮核心功能，DC則處于始動地位。多項研究證實BCG免疫調節(jié)效應的發(fā)揮與其調控DC功能及亞型密切相關。小鼠經BCG免疫后，其脾臟DC可有效抑制哮喘小鼠氣道炎癥。同

4、時，凍干BCG免疫小鼠后可以提高脾臟中類漿細胞樣DC數量。由此看來，基于BCG的哮喘防治疫苗的構建和開發(fā)是可行的。由于屋塵螨是引發(fā)哮喘的重要過敏源，因此我們前期構建了胞壁特異性表達屋塵螨抗原Derp2的重組BCG疫苗(Derp2rBCG)，并證實Derp2rBCG較BCG更有效抑制Derp2過敏性哮喘炎癥。根據這些實驗結果，我們推測Derp2rBCG較BCG以更為有效的方式調節(jié)體內DC的功能和表型，改變Derp2特異性T細胞亞群分化與功

5、能，減弱或抑制哮喘病理改變。
　　Notch信號途徑是調控機體發(fā)育過程中的重要途徑，具有高度保守性。在哺乳動物體內，Notch信號共有四個受體(Notch1，2,3,4)和五個配體(Jagged-1,Jagged-2,Delta-like1,3,4)。當配體與受體結合后，Notch受體胞內段(Notchintracellulardomain,NICD)轉入核內，與轉錄因子RBP-J結合，解除RBP-J對基因轉錄的抑制作用，同時募集

6、MAML1形成轉錄共激活物復合體，調控下游靶基因的轉錄表達。Notch通路受體和配體參與了DC與T細胞相互作用過程，不同受體和配體所產生的效應是不同的。研究發(fā)現，DC表面Delta-like1,4(Dll1,Dll4)分子可促進初始T細胞向Th1分化；而在促Th2分化的環(huán)境中，DC表面Jagged-2表達上調。Notch3誘導Th1分化，而Notch1、2與Th2分化相關。多篇文獻已報道分枝桿菌感染可影響Notch配體的表達水平。同時研

7、究人員發(fā)現，BCG進入體內后首先通過其表面病原相關分子模式（Pathogenrelatedmolecularprotein，PRMP）識別和結合DC表面的TLR9，經MyD88依賴途徑影響DC胞內Notch配體的表達，從而調控Th細胞分化發(fā)育。那么，Derp2rBCG的調節(jié)作用是否也通過調控DC胞內的各類Notch受體、配體表達來實現？值得我們關注。
　?、笮褪荏w酪氨酸激酶c-kit與其配體干細胞因子（SCF）表達于多種細胞表面，

8、具有廣泛的生物學功能，對免疫細胞的分化產生重要影響。經外界過敏原刺激后，DC胞內c-kit及其配體SCF表達水平上調進而影響Th細胞分化。有研究表明，c-kit通過上調DC胞內的IL-6以及jagged-2分子表達促進Th2細胞分化。目前，關于BCG與c-kit及SCF相互作用關系的研究報道很少，因此，Derp2rBCG是否通過上述方式影響DC胞內細胞因子水平改變進而調節(jié)jagged-2表達，最終影響Th細胞分化值得我們進一步研究。

9、r>　　我們前期研究已顯示，Derp2rBCG可有效下調哮喘小鼠氣道炎癥，其作用機制既涉及調節(jié)哮喘Th免疫偏倚，又包括誘導體內CD4+CD25+Treg的產生，引起免疫耐受。但對于Derp2rBCG如何產生上述免疫調控的機制尚待研究。鑒于DC在免疫應答反應中的特殊地位，我們以此為著眼點探索Derp2rBCG對DC表型和功能影響及可能的機制，并觀察其對各類Th細胞亞群分化的調控及對哮喘病理和病理生理的影響，為臨床哮喘疫苗的開發(fā)提供實驗依據

10、。
　　本課題主要研究結果
　　1.Derp2rBCG對小鼠不同來源DC表型及功能有部分調控作用
　　首先，原代培養(yǎng)小鼠骨髓、脾臟和肺臟來源DC，并經Derp2rBCG刺激72h。FACS分析結果顯示：Derp2rBCG體外刺激可有效提高各組DC表面MHC-II、共刺激因子CD80和CD86表達，有效活化DC，其活化能力與BCG無統(tǒng)計學差異。收集各組DC細胞培養(yǎng)液上清，ELISA檢測其中細胞因子水平改變，結果顯示：De

11、rp2rBCG和BCG均可提高IL-12水平，但前者較BCG更明顯提高不同來源DC分泌TGF-β和IL-10水平。此外，BCG上調IL-6水平，而Derp2rBCG促進三種DC分泌IL-6能力較BCG弱；隨后利用Derp2rBCG免疫小鼠42天后，分離骨髓、脾臟、肺臟淋巴結DC，FACS檢測各組DC表面分子（CD80/CD86/MHCII）改變。結果顯示：Derp2rBCG可有效活化脾臟DC和肺臟DC，其活化能力與BCG一致，但對骨髓源

12、性DC影響不明顯。將分離的脾臟，肺臟淋巴結DC培養(yǎng)6d后，ELISA檢測細胞上清中各類細胞因子含量：IL-12，TGF-β，IL-10趨勢與體外結果相似；BCG免疫組脾臟DC培養(yǎng)上清中IL-6含量較高（p＜0.05），但肺引流淋巴結DC上清中IL-6含量則無明顯變化（p＞0.05）；Derp2rBCG免疫組的脾臟DC和肺臟淋巴結DC上清中IL-6含量與對照組比較無顯著差異。另外，我們發(fā)現Derp2rBCG體內免疫后可明顯提高小鼠腹腔引流

13、淋巴結pDC的細胞比例及絕對數，而BCG則無此作用。
　　2.Derp2rBCG調節(jié)DC誘導Th0細胞向不同Th亞群分化。
　　我們首先利用CD4+CD62L+免疫磁珠試劑盒從正常小鼠脾臟分離CD4+CD62LhiT(Th0)細胞，分選效率達85％以上，將Th0細胞與經PS/BCG/Derp2rBCG刺激的DC，按5：1比例共培養(yǎng)，經Derp2抗原刺激72h，隨后收集T細胞，經FACS檢測Th0細胞向各個亞群分化比率。結果顯

14、示：與PS比較，Derp2rBCG和BCG具有更強誘導Th1亞群分化和抑制Th2亞群分化的功能。同時，我們發(fā)現BCG可誘導體外Th17細胞分化，但Derp2rBCG則無此作用。值得注意的是，Derp2rBCG比BCG組具有更強的誘導CD4+CD25+Foxp3+T細胞產生的能力。體內試驗中，我們將PS/BCG/Derp2rBCG免疫小鼠42天后制備哮喘模型，分離肺臟引流淋巴結，用尼龍膜過濾制成單細胞懸液，FACS分析結果顯示：Derp2

15、rBCG和BCG均可抑制哮喘小鼠Th2細胞過度分化，上調Th1細胞；前者明顯減少Th17比例，而后者則促進Th17的產生；前者顯著提高CD4+CD25+Foxp3+T細胞比率，而后者的影響并不明顯。
　　3.Derp2rBCG調節(jié)DC功能的分子機制
　　以上2部分實驗初步證實了Derp2rBCG具有通過調控DC功能及表型從而影響Th0細胞向各個不同Th細胞亞群分化的能力。隨后，我們初步研究了參與這種調控的分子信號通路。我們利

16、用Real-timePCR和Westernblot方法檢測到Derp2rBCG與BCG均能顯著上調DC內Dll-4的表達水平，但對Dll-1、3表達均無明顯影響。Derp2rBCG可下調DC內Jagged-2表達，其作用能力較BCG更強。OxPAPC可阻斷Derp2rBCG的上述作用。Derp2rBCG刺激DC內c-kit表達的能力較BCG低。
　　4.Derp2rBCG-DC在哮喘小鼠模型中發(fā)揮免疫調節(jié)作用
　　為進一步證

17、實經Derp2rBCG調控的DC在體內具有免疫調節(jié)能力，我們進行了體內DC移植實驗。首先分離出經PS/BCG/Derp2rBCG免疫后的小鼠腹腔淋巴結DC，將其移植入Derp2抗原致敏的小鼠體內，再經抗原激發(fā)構建哮喘小鼠模型。實驗動物分6組：正常小鼠組、哮喘模型組、Derp2rBCG-DC移植組、BCG-DC移植組、PS-DC移植組和Derp2rBCG-DC移植+PC61組。經HE，AB-PAS染色法觀察小鼠肺組織病理學改變，結果顯示：

18、Derp2rBCG-DC移植組小鼠肺組織炎癥較哮喘模型組明顯減輕，氣道粘液分泌減少；Derp2rBCG-DC可降低哮喘小鼠氣道高反應性；ELISA結果提示：Derp2rBCG-DC移植組小鼠肺泡灌洗液中Th1細胞因子上調，Th2細胞因子下調，調節(jié)性細胞因子TGF-β,IL-10水平增高；FACS結果顯示Derp2rBCG-DC移植組小鼠肺臟引流淋巴結中Th1，CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例及絕對數上升，而Th2細胞亞群比

19、例及絕對數下降；值得注意的是，使用Treg清除劑PC61可有效逆轉該現象。
　　結論
　　1）Derp2rBCG與BCG一樣可上調DC表面MHC-II、共刺激因子CD80和CD86表達水平，有效活化DC。此外，Derp2rBCG體內免疫還可以提高小鼠腹腔引流淋巴結中pDC的比例與細胞絕對數；
　　2）Derp2rBCG對DC誘導Th0向各個Th細胞亞群分化產生重要影響。Derp2rBCG與BCG相似，均能刺激不同來源D

20、C釋放Th1細胞因子，但前者能更有效地刺激DC分泌調節(jié)性細胞因子TGF-β，IL-10，從而具有更強的誘導CD4+CD25+Foxp3+T細胞分化的能力。Derp2rBCG促DC分泌IL-6能力較BCG弱；
　　3）Derp2rBCG通過TLR途徑調控DC內Notch配體表達，進而影響Th1/Th2細胞亞群比例；
　　4）Derp2rBCG促進DC內c-kit表達能力較BCG低，因此產生較少的IL-6，從而誘導Th17細胞分