雙組份系統(tǒng)AfsQ1-Q2對天藍鏈霉菌中coelimycin P2合成的調控機制的研究.pdf

1、鏈霉菌具有豐富的代謝調控機制，由于鏈霉菌在抗生素合成中的重要地位，研究鏈霉菌的次級代謝特別是抗生素合成的調控機制具有重要的研究意義。本文主要研究天藍鏈霉菌中的雙組份調控系統(tǒng)AfsQ1/Q2對抗生素coelimycin P2（也被稱為yCPK）合成的調控機制。
　　之前的研究表明，在以75mM的谷氨酸鈉（Glu）為唯一氮源的基本培養(yǎng)基（MM）上，天藍色鏈霉菌中的雙組份調控系統(tǒng)（TCS）AfsQ1/Q2可以激活黃色的抗生素coelim

2、ycin P2（也被稱為yCPK）的產生，并且應答調控蛋白AfsQ1能夠結合到coelimycin P2的兩個生物合成基因cpkA和cpkD的基因間隙。本文對此進行了更加深入的研究。為了排除放線紫紅素（ACT）、十一靈菌紅素(RED)（分別呈現(xiàn)藍色和紅色）對我們肉眼觀察coelimycin P2產量變化的干擾，本研究以野生型天藍鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）M145為出發(fā)菌株，敲除了ACT和RED生物合成基因簇

3、中的途徑特異性調控基因actII-ORF4、redD，獲得菌株SBJ512，該菌株喪失ACT和RED的合成能力。我們首先探究了在基本培養(yǎng)基（MM）上，不同濃度的谷氨酸鈉對coelimycin P2合成的影響，發(fā)現(xiàn)在谷氨酸鈉濃度為75mM的條件下， SBJ512的coelimycin P2的合成量最多。在含有75mM的谷氨酸鈉為唯一氮源的MM培養(yǎng)基上，探究了雙組份系統(tǒng)基因afsQ1/Q2缺失對coelimycin P2合成的影響。結果表明

4、，當缺失afsQ1/Q2之后，突變菌株SBJ513停止合成coelimycin P2，并且我們對coelimycin P2合成基因簇進行了轉錄分析，發(fā)現(xiàn)afsQ1/Q2缺失導致整個coelimycin P2生物合成基因簇轉錄的顯著下調，其中cpkA/B/C轉錄下調的最厲害，下調了約20倍，凝膠阻滯實驗（EMSA）表明， AfsQ1僅僅能夠結合到coelimycin P2合成基因簇中聚酮合酶基因cpkA/cpkD之間的間隙區(qū)，而不能結合到

5、基因簇內其他可能的啟動子區(qū)域。根據(jù)之前蛋白AfsQ1結合基序的保守性，在cpkA/cpkD之間找到了AfsQ1的結合序列，并對其進行原位堿基突變，構建了突變體SBJ514。對該菌株進行轉錄分析發(fā)現(xiàn)，cpkA/D基因間隔區(qū)內AfsQ1結合位點的突變僅引起 cpkA/B/C（編碼三個大的Ⅰ類聚酮合酶）的轉錄下調，而其他基因的轉錄水平沒有明顯的變化或有明顯上調。這些結果表明，AfsQ1/Q2可能通過結合于cpkA和cpkD的基因間隙區(qū)，影響3