殼聚糖-藻酸鹽復合凝膠作為髓核組織工程支架的體外實驗研究.pdf

1、研究背景： 腰痛是現(xiàn)代化社會中一種常見的癥狀，是導致勞動力喪失的主要原因之一，腰椎間盤突出癥等椎間盤退行性疾病(DDD)是引起腰痛最常見的原因。伴隨人體的老化，椎間盤也相應發(fā)生退行性改變，外科治療方法如椎間盤切除或椎間融合術等手段是以犧牲椎間盤節(jié)段功能為代價的，而且會導致相鄰節(jié)段更快的退變。如何延緩和降低椎間盤退變的速率，以及研究符合椎間盤包括髓核結構與功能的移植物，對退變椎間盤進行功能重建，已成為椎間盤退行性疾病比較理想的解決

2、方案。 組織工程是一個新興的學科，通過將細胞與支架材料復合，加以生長因子。理想的結果可以修復或替換無功能或退變的組織器官．組織工程學的迅速發(fā)展和關鍵技術的突破，促進了髓核組織工程的發(fā)展。種子細胞和支架材料是其關鍵的問題。干細胞作為組織工程的種子細胞有其不可替代的優(yōu)勢，胚胎干細胞由于醫(yī)學倫理上的爭議受到限制，而間質干細胞(MSCs)可從成人獲取，應用廣泛，除了骨髓外，脂肪組織同樣可分離出干細胞。髓核細胞的起源目前還不肯定，但大多數(shù)

3、的研究者認為其與軟骨細胞非常類似，稱其為軟骨樣細胞。脂肪干細胞(ADSCs)具有多向分化潛能，可以誘導分化為軟骨樣細胞，被認為是理想的種子細胞；髓核組織的特殊生理結構和力學性能要求髓核組織工程支架應該同時滿足以下條件：①生物相容性良好；②降解速率適當；③三維立體多孔結構；④具有一定的機械強度；⑤良好的細胞界面；⑥加工性能優(yōu)異等。本課題選用ADSCs作為種子細胞，制備殼聚糖/藻酸鹽凝膠支架材料，研究殼聚糖/藻酸鹽凝膠材料對ADSCs增殖和

4、分化的影響；并對其作為髓核組織工程的支架材料的重要指標如孔隙率、孔隙大小、以及細胞在該支架材料上的增殖能力進行了探討。 目的： 1．進一步明確兔ADSCs在體外培養(yǎng)條件下的生物學特性及其成軟骨能力，探索更為有效的ADSCs體外培養(yǎng)方法。 2．制備殼聚糖—藻酸鹽復合凝膠材料，檢測該三維支架材料的孔隙情況和初步探討該復合材料的細胞相容性，研究殼聚糖—藻酸鹽復合凝膠對兔ADSCs增殖和分化影響，為殼聚糖—藻酸鹽復合凝膠

5、作為髓核組織工程中ADSCs的載體提供實驗依據(jù)。 方法： 1．提取兔原代ADSCs，用DMEM完全培養(yǎng)基和成軟骨誘導條件培養(yǎng)基(CM)體外培養(yǎng)，進行干細胞檢測，倒置相差顯微鏡和HE染色觀察細胞形態(tài)；活細胞計數(shù)繪制細胞生長曲線；計算細胞貼壁率，AB和VanGieson染色以判斷細胞是否向成軟骨樣細胞分化。 2．制備殼聚糖—藻酸鹽凝膠支架，掃描電鏡觀察材料結構，計算孔隙大小，孔隙率。 3．將兔ADSCs接種于

6、殼聚糖—藻酸鹽支架上，用成軟骨誘導培養(yǎng)液(CM)培養(yǎng)，同時設立對照組，通過掃描電鏡、阿利新藍、番紅O染色進行組織形態(tài)學觀察；在培養(yǎng)7d、14d、21d時取標本行組織學檢測，測定培養(yǎng)物中糖胺聚糖(GAG)含量及Ⅱ型膠原的含量量。 結果： 1．體外培養(yǎng)的兔原代ADSCs貼壁生長，呈梭形和多角形，傳代后細胞分裂增殖活躍；誘導后的ADSCs的形狀趨向于類圓形，使用條件培養(yǎng)基向成軟骨誘導后的兔ADSCs倍增時間由34.90h延長至

7、43.73h，即增殖速度減慢；VanGieson染色及AB染色顯示有Ⅱ型膠原成分和蛋白聚糖成分。 2．殼聚糖—藻酸鹽支架具有網狀孔隙結構，孔徑大小在50μm-200μm之間，并有較高的孔隙率，為80.57％。 3．倒置顯微鏡及掃描電鏡觀察細胞在支架中生長良好。體外培養(yǎng)7d、14d、21d時，誘導組培養(yǎng)液中細胞外基質sGAG含量(ug/ml)分別為：18.69±3.56，53.92±3.22，73.97±7.31；DMEM

8、組培養(yǎng)液中細胞外基質GAG含量(ug/ml)分別為：21.31±2.1，36.63±4.14，38.02±9.34，兩組間比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；Ⅱ型膠原含量兩組間比較有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。阿里新藍染色和番紅O染色陽性。 結論： 1．脂肪干細胞提取方便，成軟骨誘導的脂肪干細胞細胞表現(xiàn)出軟骨樣細胞的生物學特性，可以作為髓核細胞組織工程的種子細胞。 2．殼聚糖—藻酸鹽凝膠三維支架具有較理想的髓核組織