miR-129促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞多西紫杉醇耐藥的探索性研究.pdf

1、乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤,在我國其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。在肯定化療效果的同時,我們不得不承認(rèn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的針對多種藥物的耐藥現(xiàn)象是乳腺癌治療失敗的重要原因。隨著microRNA在腫瘤發(fā)生和耐藥研究的不斷深入,microRNA已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的焦點,并取得了一定的進(jìn)展。我們通過生物信息學(xué)分析預(yù)測了可能參與乳腺癌多藥耐藥的microRNA分子,基于分子克隆相關(guān)技術(shù)構(gòu)建了慢病毒表達(dá)載體,利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)、Western Bl

2、ot和細(xì)胞轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)相關(guān)實驗篩選出參與乳腺癌耐藥的microRNA分子,并進(jìn)一步分析了其可能的相關(guān)作用機(jī)制,為有效逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥和提高乳腺癌的臨床化療療效提供了新的思路。研究可分為三部分:
　　第一部分:乳腺癌過表達(dá)MDR1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系和乳腺癌多西紫杉醇耐藥細(xì)胞系的建立。在乳腺癌治療中,多藥耐藥現(xiàn)象產(chǎn)生的主要原因之一是MDR1基因的過表達(dá),我們通過分子克隆技術(shù)成功在MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞中建立了多藥耐藥基因M

3、DR1的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。慢病毒載體作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)工具,相比逆轉(zhuǎn)錄載體最大的優(yōu)勢是可以同時感染分裂和非分裂期的細(xì)胞。通過將外源性基因整合入宿主細(xì)胞基因組,使得目的基因獲得長期穩(wěn)定的表達(dá)。慢病毒感染的靶細(xì)胞范圍很廣,包括神經(jīng)元、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種類型。上述優(yōu)點使得慢病毒在基礎(chǔ)研究及基因治療領(lǐng)域都具有廣闊的應(yīng)用前景。通過Invitrogen公司Gateway核心技術(shù)將含有全長MDR1基因的入門載體成功重組入慢病毒骨架載體pLenti6.3/V

4、5-DEST。為了使外源基因MDR1能在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中穩(wěn)定持續(xù)表達(dá),應(yīng)用第二代慢病毒包裝系統(tǒng)包裝病毒,并轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞,在靶細(xì)胞中獲得高達(dá)90％以上的感染率。為獲得MDR1穩(wěn)定整合的細(xì)胞,通過4周的滅瘟素(Blasticilin10μg/ml)篩選,最終建立穩(wěn)定的MDR1基因過表達(dá)的乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞株。研究結(jié)果顯示,MDR1基因及其編碼的蛋白可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥能力。另一方面

5、,為了獲得乳腺癌多西紫杉醇耐藥細(xì)胞株,我們選擇了MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞作為靶細(xì)胞。通過10個月的持續(xù)劑量多西紫杉醇維持篩選(2μM),我們獲得了穩(wěn)定的多西紫杉醇耐藥細(xì)胞系。為深入研究乳腺癌的多西紫杉醇耐藥機(jī)制奠定了良好的實驗基礎(chǔ)。
　　第二部分:作用于靶基因MDR1的候選miRNA分子慢病毒載體的構(gòu)建和篩選。通過生物學(xué)信息分析,我們預(yù)測出以MDR1基因作為靶基因的五種miRNAs,并成功構(gòu)建了其慢病毒表達(dá)載體。利用雙熒光素

6、酶報告基因系統(tǒng)、Western Blot、細(xì)胞增殖-毒性實驗等方法,發(fā)現(xiàn)miR-129參與了乳腺癌多西紫杉醇耐藥的過程。
　　第三部分:miR-129參與乳腺癌多西紫杉醇耐藥的機(jī)制研究及其對乳腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。為了深入研究miR-129在乳腺癌多西紫杉醇耐藥中的作用,我們成功構(gòu)建了MDA-MB-231/miR-129和MCF-7/miR-129過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,Real-timePCR結(jié)果顯示miR-129-3P在MD

7、A-MB-231/miR-129和MCF-7/miR-129細(xì)胞中高表達(dá)。同時發(fā)現(xiàn),miR-129-3P在多西紫杉醇耐藥細(xì)胞系MDA-MB-231-R中也呈高表達(dá)狀態(tài)。在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)miR-129后,細(xì)胞增殖-毒性實驗驗證了miR-129可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞獲得耐藥性。平板克隆實驗和EdU染色檢測結(jié)果顯示miR-129可發(fā)揮促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖的作用。在MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的miR-129-3