肺泡上皮間緊密及縫隙連接在急性肺損傷中結構及功能的改變.pdf

1、研究背景： 急性肺損傷(Acutelunginjury,ALI)是以間質性水腫和肺實質細胞損傷為主要表現的急性呼吸衰竭，后期則發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(Acuterespiratorydistresssyndrome，ARDS)。其特點是發(fā)病急、病情兇險、死亡率高(達50％)，發(fā)病機理至今尚未完全闡明，臨床上沒有特效的治療方法。因此探討ALI發(fā)病機制和救治方法是當前臨床亟待解決的難題之一。肺泡上皮細胞(alveolarepith

2、elialcell，AEC)之間的連接包括緊密連接(Tightjunction，TJ)和縫隙連接(Gapjunction，GJ)。這兩種細胞的連接方式保證了肺泡組織血氣屏障的完整性，發(fā)揮著調節(jié)細胞兩側及細胞內外液體、離子、代謝產物的分布、轉移及細胞之間的信號傳遞。TJ有兩個基本的功能，即屏障功能(barrierfunction，BF)和柵欄功能(fencefunction，FF)。TJ的屏障功能可以調節(jié)水，離子，不同大小的分子甚至是癌細

3、胞通過細胞之間的間隙，其BF與水腫、黃疸、腹瀉及腫瘤的轉移等病理過程相關。而TJ的柵欄功能則與細胞的極性有關，換言之，TJ就像柵欄一樣阻止細胞膜頂膜上的分子與側膜上的分子相互混合，這種功能與腫瘤生物學即細胞極性的喪失有密切的聯(lián)系。GJ形成的細胞間通道為縫隙連接通道(gapjunctionchannel)，能通過大小約1000Da的物質，可使親水性的離子、分子、代謝產物或信號轉導分子直接彌散，從而發(fā)揮門控作用，調節(jié)離子、電流、低分子代謝產

4、物在細胞之間的相互轉運及分布。 方法： 1.動物模型的復制：采用OA(按0.25mi/Kg體重的劑量)經大鼠尾靜脈緩慢注入復制ALI模型，分別于注射OA后1、5、12、24和48小時剪斷腹主動脈放血處死，取出肺臟。將取出的一部分肺組織經電鏡液固定等處理后分別用掃描電鏡和透射電鏡觀察肺泡超微結構的變化；取出的另一部分肺組織制成蠟塊經切片后用HE染色法觀察肺組織結構的變化。 2.石蠟切片應用免疫組織化學(immuno

5、histochemistry,IH)SP法檢測Cx26、Claudin-3在正常肺組織及急性肺損傷組織中的表達，光鏡下觀察，數出每個隨機視野中的陽性細胞數和總細胞數，并計算出每張切片的陽性細胞率。 3.石蠟切片應用原位雜交(insituhybridization，ISH)方法檢測Cx32mRNA在正常肺組織及急性肺損傷組織中的表達，光鏡下觀察，數出每個隨機視野中的陽性細胞數和總細胞數，并計算出每張切片的陽性細胞率。 4.

6、統(tǒng)計學處理采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對各組均數的比較進行單因素方差分析，如有顯著性差異，需進一步作多重比較。若方差齊性則采用LSD法作兩兩間的比較；若方差不齊則采用Tamhane'sT2法作兩兩比較，檢驗水準為α=0.05。 結果： 1.損傷組在注射OA后都出現不同程度的呼吸加快、窘迫、紫紺及泡沫血痰等表現。正常對照組不出現上述表現。取出的損傷肺體積明顯增大，呈廣泛的充血、水腫及出血樣改變，肺邊緣變鈍，以雙側中、下肺葉

7、病變較重，氣管內有粉紅色泡沫樣痰；HE染色切片光鏡下可見肺泡壁明顯增寬，肺間質充血、出血、炎性細胞浸潤，肺間質和肺泡水腫，肺泡腔內可見淡紅染水腫液和大量中性粒細胞滲出。正常對照組肺組織結構無明顯變化。 2.電鏡下肺組織超微結構的改變：透射電鏡下急性肺損傷大鼠可見肺間質細胞大量破壞，無法辨認細胞的形態(tài)及結構，見不到完整的細胞間連接結構，Ⅰ型肺泡上皮細胞膜斷裂，細胞核溶解；而正常大鼠肺泡上皮細胞形態(tài)結構完整，肺泡上皮細胞之間存在完整

8、的細胞連接結構。掃描電鏡下可見正常大鼠肺泡壁光滑，肺泡內無滲出物質；而急性肺損傷大鼠的肺泡腔內充滿顆粒和絮狀物質，這些物質與肺泡上皮細胞或肺間質相連并在肺泡腔內纏繞形成球形顆粒或相互連結形成網狀結構。 3.Cx26的表達及其表達的變化：免疫組化顯示Cx26陽性染色主要定位于胞膜上和細胞質中。Cx26在正常組及損傷后1、5、12、24、48小時組的陽性表達率分別為(12.25±1.12)％、(9.11±0.62)％、(5.71±0

9、.52)％、(6.22±0.77)％、(6.64±0.53)％、(8.25±0.53)％。各組Cx26陽性細胞的平均百分率方差齊性(P=0.393)，方差分析有顯著性差異(F=115.638,P＜0.001)，進一步用LSD法做各組間的多重比較。LSD檢驗結果：正常對照組與損傷各組的陽性細胞率有顯著性差異(P＜0.001)；損傷后5小時與損傷后12小時組、損傷后12小時與損傷后24小時組間無顯著性差異(P值分別為0.115、0.193)

10、；其它各組間的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。損傷5小時后Cx26的陽性表達率有上升趨勢。 4.CX32mRNA表達及其變化：原位雜交顯示Cx32mRNA的表達主要定位于細胞質中。Cx32mRNA在正常組及損傷后1、5、12、24、48小時組的陽性表達率分別為(13.95±1.57)％、(5.53±0.98)％、(4.83±1.00)％、(5.27±0.93)％、(6.80±0.87)％、(8.92±0.73)％。各組Cx32

11、mRNA陽性細胞的平均百分率方差齊性(P=0.201)，方差分析有顯著性差異(F=109.804,P＜0.001)，進一步用LSD法做各組間的多重比較。LSD檢驗結果：正常組與損傷各組比較有顯著性差異(P＜0.001)；損傷后48小時組與其余各組比較有顯著性差異(P＜0.001)；損傷后1小時組與5小時組、1小時組與12小時組、5小時組與12小時組間比較無顯著性差異(P值分別為0.140、0.585、0.348)；其余各組間的比較有顯著

12、性差異(P＜0.05)。損傷5小時后Cx32mRNA的陽性表達率有上升趨勢。 5、claudin-3表達及其變化：免疫組化結果顯示claudin-3陽性染色主要定位于胞膜上和細胞質中。claudin-3在正常組及損傷后1、5、12、24、48小時組的陽性表達率分別為(18.45±2.37)％、(12.08±1.10)％、(9.19±1.08)％、(7.75±1.70)％、(11.81±2.07)％、(13.54±1.21)％。各

13、組claudin-3陽性細胞的平均百分率方差齊性(P=0.127)，方差分析有顯著性差異(F=50.523,P＜0.001)，進一步用LSD法做各組間的多重比較。LSD檢驗結果：正常組與損傷各組比較有顯著性差異(P＜0.001)；損傷后1小時組與24小時組、1小時組與48小時組、5小時組與12小時組間比較無顯著性差異(P值分別為0.714、0.055、0.058)；其余各組間的比較有顯著性差異(P＜0.05)。損傷12小時后claudi