孕期高糖對子代大鼠RAS介導的腸系膜動脈血管張力的影響及離子通道機制研究.pdf

1、研究背景：高血壓發(fā)病由基因和環(huán)境因素的綜合作用所引起，而孕期營養(yǎng)不當包括高鹽、高脂肪或低蛋白飲食等作為孕期不良環(huán)境因素與胎源性高血壓發(fā)病密切相關。愈來愈多的研究證據表明，孕期母體營養(yǎng)不當可引起出生低體重兒或肥胖兒，胎兒在其發(fā)育關鍵階段暴露于母體營養(yǎng)失衡的環(huán)境，可對其心血管發(fā)育產生多種不良影響，可致其在成年期罹患高血壓等心血管疾病的風險增加。高血壓發(fā)病與外周阻力動脈管壁增厚及血管張力增強導致的循環(huán)阻力增加有關。血管張力及血壓調控與鈣、鉀離

2、子通道功能活動密切相關，其中特別是L-型電壓門控性鈣通道(L-type voltage-gated Ca2+channels，L-Ca2+)與大電導鈣依賴性鉀通道(Large-conductance Ca2+-activated K+channels，BK)對血管張力及血壓調控起重要作用。L-Ca2+通道功能活動受細胞膜電位影響，主要調控細胞外Ca2+進入平滑肌細胞內，使得細胞內游離鈣離子濃度(intracellular free Ca

3、2+concentration，[Ca2+]i)升高，誘發(fā)血管收縮；而BK通道作為影響細胞膜電位的主要通道之一，可被[Ca2+]i升高及膜電位去極化所激活，由此發(fā)揮對細胞膜電位及血管張力的負反饋調節(jié)作用。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)包括循環(huán)RAS和血管局部組織RAS，作為機體重要的內分泌系統(tǒng)，在調節(jié)體液平衡和心血管活動方面起重要作用。研究表明高鹽或高糖飲食可誘導動物發(fā)生高血壓，其發(fā)病關

4、鍵環(huán)節(jié)之一在于血管功能異常。然而，孕期高糖飲食是否及如何影響子代血管功能，是否對成年子代血管RAS及離子通道活動產生“印跡”效應，從而影響子代血管張力與血壓調控，目前尚鮮見報道。本實驗擬研究孕期高糖飲食對成年子代大鼠外周阻力動脈血管功能調控的“印跡”效應及其離子通道機制。
　　 第一部分孕期高糖對子代心血管功能及腸系膜動脈血管張力的影響
　　 目的：研究孕期母體高糖飲食對成年子代大鼠諸如血壓、心率等心血管功能指標和腸系膜

5、動脈血管張力調控的“印跡”效應，并在離體組織層面初步闡明RAS與BK通道改變在高糖子代外周阻力動脈血管張力調節(jié)中的作用及其對血壓調控的影響。方法：實驗組孕鼠從妊娠第1天至妊娠第21天給予孕期全程高糖飲食(正常鼠糧+20％蔗糖水溶液)，對照組孕鼠給予全程正常飲食(正常鼠糧+自來水)。在臨產前1天通過腹主動脈隨機取部分母鼠血液，用于檢測血糖；同時取其胎鼠，稱量體重及檢測血糖。自然分娩后，在哺乳期內實驗組與對照組母鼠均給予正常飲食，幼鼠進行母

6、乳喂養(yǎng)。之后，子代大鼠全部給予正常飲食，生長至5個月后用于實驗。隨機抽選部分子代成年大鼠，測體重，并在麻醉條件下通過腹主動脈取血用于檢測血糖。部分子代大鼠行股動、靜脈插管術，以PowerLab生理記錄儀在體動態(tài)監(jiān)測動物清醒無應激條件下的血壓、心率等指標。部分子代分離腸系膜動脈后，制備血管環(huán)，以PowerLab生理記錄儀檢測血管張力情況，以熒光鈣成像儀檢測血管細胞內鈣情況。結果：孕期高糖飲食對胎鼠和成年子代的血糖無明顯影響，但可引起胎鼠體

7、重增加，而成年子代體重無明顯差異。孕期高糖飲食對成年子代在基礎狀態(tài)下的血壓、心率無明顯影響，但靜脈給予血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)刺激后，高糖子代的收縮壓、舒張壓、平均動脈壓和心率均出現(xiàn)一過性的明顯升高。在離體條件下，AngⅡ所誘導的腸系膜動脈血管張力和細胞內游離鈣離子濃度在高糖組亦明顯升高；分別以BK通道阻斷劑、AT1/AT2受體阻斷劑預先孵育后，與對照組相比，高糖子代血管張力出現(xiàn)明顯的不同改變。
　　

8、結論：孕期高糖飲食可影響成年子代腸系膜動脈血管張力及血壓等心血管功能活動，可能與血管組織BK通道及AT1/AT2受體改變有關。
　　 第二部分孕期高糖對子代腸系膜動脈鈣通道功能活動的影響
　　 目的：研究孕期高糖飲食對成年子代腸系膜動脈平滑肌細胞電壓門控性鈣通道功能活動和膜電位的影響及其與血管張力調控的關系。方法：在體視顯微鏡下分離實驗組和對照組腸系膜動脈，以兩步酶解消化法分離血管平滑肌細胞，應用Axon700B膜片鉗放

9、大器及Clampex10.1軟件進行數(shù)據記錄。電壓門控性鈣通道電流以Ba2+作載體，并在電極內液中加Cs+及細胞外液中加TEA和4-AP來阻斷鉀電流，采用傳統(tǒng)全細胞電壓鉗模式來記錄全細胞鈣電流。換另一批細胞，使用記錄鉀電流的細胞外液與電極內液，在傳統(tǒng)全細胞電流鉗模式(I=0)下記錄細胞膜電位。結果：與對照組相比，孕期高糖組成年子代大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞全細胞鈣電流在基礎狀態(tài)下明顯增強，細胞靜息膜電位發(fā)生明顯去極化改變；給予AngⅡ刺激

10、后，高糖組和對照組全細胞鈣電流均增強，高糖組增強的更為明顯，而細胞膜電位均進一步發(fā)生明顯去極化改變。結論：孕期高糖飲食可明顯增強成年子代大鼠血管平滑肌細胞電壓門控性鈣通道電流，其功能活動的增強可能主要與細胞膜電位去極化改變有關。
　　 第三部分孕期高糖對子代腸系膜動脈鉀通道功能活動的影響
　　 目的：研究孕期高糖飲食對成年子代腸系膜動脈平滑肌細胞鉀離子通道特別是BK通道功能活動的影響及其與血管張力調控的關系，并探討高糖子

11、代血管RAS受體與BK通道功能活動改變的分子基礎及其對平滑肌細胞鉀電流的影響。方法：在體視顯微鏡下分離實驗組和對照組腸系膜動脈，以兩步酶解消化法分離血管平滑肌細胞，應用Axon700B膜片鉗放大器及Clampex10.1軟件進行數(shù)據記錄，細胞槽內持續(xù)低速灌流記錄鉀電流的細胞外液，電極內充以相應的電極內液，在傳統(tǒng)全細胞電壓鉗模式下記錄全細胞鉀電流。另外，用Western blot方法檢測腸系膜動脈血管BK通道α亞基、AT1及AT2受體蛋白

12、表達。結果：與對照組相比，孕期高糖組成年子代大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞全細胞鉀電流在基礎狀態(tài)下明顯減弱；給予AngⅡ刺激后，高糖組和對照組鉀電流均進一步減少；分別給予AT1/AT2受體阻斷劑Losartan和PD123319預先孵育后，AngⅡ所誘導的全細胞鉀電流發(fā)生不同改變。高糖組子代腸系膜動脈BK通道α亞基表達減少，AT1受體表達增加而AT2受體表達減少。結論：孕期高糖飲食對其成年子代血管平滑肌細胞鉀離子通道功能活動產生“印跡”效應，