樹突狀細胞在胃癌組織中的功能變化及其抗癌作用的實驗研究.pdf

1、研究內容和結果如下：第一部分胃癌及區(qū)域淋巴結中浸潤性樹突狀細胞功能變化及其臨床意義 目的：研究胃癌及區(qū)域淋巴結中浸潤性樹突狀細胞(tumorinfiltratingdendriticcell，TIDC)的DC特異標志CD83及共刺激分子CD80、CD86的表型變化，探討胃癌及區(qū)域淋巴結中TIDC功能狀態(tài)與胃癌發(fā)生、發(fā)展及其與胃癌臨床生物學行為的關系。 方法：提取胃癌組織、癌旁組織、正常胃組織、有轉移和無轉移區(qū)域淋巴結中的

2、TIDC，并經細胞因子體外刺激擴增，流式細胞術檢測TIDC的CD83、CD80、CD86表型變化，探討其與胃癌發(fā)生、發(fā)展及與胃癌臨床生物學行為的關系。 結果1胃癌組織及區(qū)域淋巴結、正常胃組織中TIDC經培養(yǎng)擴增后，在倒置顯微鏡下和瑞氏染色后形態(tài)觀察可見典型的樹突狀改變，細胞呈不規(guī)則的圓形，周邊可見樹突狀突起。 2胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織中TIDC的CD83表達分別為7.24±2.09％、11.73±2.62％、12

3、.92±3.28％；CD80的表達分別為5.39±1.9％、9.32±2.05％、10.61±2.60％；CD86表達分別為15.01±3.22％、19.97±5.31％、21.24±4.90％，胃癌組織中TIDC的CD83、CD80和CD86的表達分別顯著低于癌旁組織及正常胃組織，差異有顯著性(P＜0.01)。3在有轉移和無轉移淋巴結中TIDC的CD83表達分別為8.17±1.67％、13.58±3.71％；CD80的表達分別為6.6

4、0±1.27％、11.79±2.52％；CD86的表達分別為13.89±3.46％、22.02±5.18％，有轉移組TIDC的CD83、CD80和CD86的表達分別顯著低于無轉移淋巴結，差異有顯著性(P＜0.01)。 4胃癌組織中TIDC的CD83、CD80、CD86表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度無關(P＞0.05)。而三者在低分化腺癌組、有轉移淋巴結組和Ⅲ+Ⅳ期組的表達明顯低于高中分化組、無轉移淋巴結組、Ⅰ+Ⅱ期組，

5、差異有顯著性(P＜0.01或0.05)。 結論：胃癌組織和有轉移的區(qū)域淋巴結中成熟TIDC數量減少、共刺激分子表達下降，DC的抗原提呈功能低下，機體對胃癌細胞的識別能力減退，從而產生胃癌免疫逃逸，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關。胃癌組織中TIDC的功能狀態(tài)可能受到胃癌細胞本身特性的影響。為闡明胃癌免疫逃逸機制、開展胃癌的免疫生物學治療提供了理論和臨床基礎。 第二部分人外周血樹突狀細胞的擴增及人胃癌細胞培養(yǎng)上清液對其表型的影響

6、 目的：研究不同人胃癌細胞培養(yǎng)上清液對人外周血成熟DC表型的影響，探索DC功能下降的機制，為胃癌的免疫生物治療提供實驗依據。 方法：自健康人外周血誘導培養(yǎng)獲取大量具有典型形態(tài)學特征的DC，掃描電鏡、透射電鏡觀察DC的形態(tài)，FCM檢測DC的CD83、CD80、CD86、HLA-DR表型。并獲取不同胃癌細胞及正常胃上皮細胞的培養(yǎng)上清液，酶聯(lián)免疫法檢測上清液中的血管內皮生長因子(VEGF)、白細胞介素-10(IL-10)、轉化生長

7、因子-β1(TGF-β1)蛋白含量。DC培養(yǎng)液中加入胃癌細胞培養(yǎng)上清液，流式細胞術檢測DC表型的變化。 結果1DC的形態(tài)學觀察：倒置顯微鏡下觀察DC細胞形態(tài)不規(guī)則，表面有大量的毛刺狀突起。掃描電鏡觀察DC表面粗糙，胞體向四周伸出大量樹枝狀或裙褶狀不規(guī)則突起。透射電鏡觀察成熟DC的胞體較大，可見明顯的突起。胞漿細胞器，如粗、滑面內質網、核糖體、線粒體、高爾基體等較發(fā)達。 2DC的表型測定：培養(yǎng)第7d的DC高表達CD83、H

8、LA-DR，表達率分別為(61.94±5.87)％、(72.26±7.65)％，中度表達CD80、CD86，表達率分別為(43.81±6.19)％、(51.07±4.32)％，較第4天均顯著升高，差異有顯著性(P＜0.01)。在培養(yǎng)過程中不加刺激因子DC的CD83表型基本不表達，HLA-DR、CD80、CD86的表達明顯低于加刺激因子的DC，差異有顯著性(P＜0.01)。 3在培養(yǎng)上清液中，三種人胃癌細胞均可檢到VEGF蛋白，I

9、L-10、TGF-β1蛋白在OCUM-2MD3、BGC-823細胞株中有表達，在HGC-27中未見表達。而在正常胃上皮細胞GES-1中均未檢測到這三種免疫抑制因子。4加入胃癌細胞培養(yǎng)上清液后，流式細胞術檢測各胃癌細胞組DC的CD83、HLA-DR表型及共刺激分子CD80、CD86的表達均顯著降低(P＜0.01)，而正常胃上皮細胞培養(yǎng)上清液對DC表型無顯著影響。 結論：經提取人外周血PBMC，GM-CSF、IL-4和TNF-α體外

10、刺激，可擴增出大量成熟、具備抗原提呈能力的DC，該方法簡便、易行、高效。胃癌細胞可通過分泌VEGF、IL-10、TGF-β1等免疫抑制因子抑制DC成熟，降低其抗原提呈功能，使胃癌發(fā)生免疫逃逸。 第三部分胃癌細胞抗原致敏的樹突狀細胞誘導T淋巴細胞增殖和殺傷效率的實驗研究目的：探討胃癌細胞抗原致敏的DC誘導T淋巴細胞增殖和殺傷胃癌細胞的效率，為胃癌的免疫生物治療提供新的治療途徑和實驗依據。 方法：自健康人外周血誘導培養(yǎng)獲取成

11、熟DC，自同一人提取外周血、擴增T淋巴細胞，流式細胞術檢測其CD3、CD4、CD8及CD56表型。 以人胃癌OCUM-2MD3細胞株凍融抗原致敏DC，MTT法檢測致敏DC對T細胞增殖的影響和致敏DC活化的特異性CTL對胃癌細胞的體外殺傷效率。 結果1人外周血中提取的PBMC，在體外培養(yǎng)，經rhIL-2、rhGM-CSF刺激后，可獲大量表達CD3的T淋巴細胞。 2經MTT法檢測胃癌細胞抗原致敏DC對人外周血T淋巴細

12、胞增殖的影響，可見致敏DC組的SI值為0.573±0.115，未致敏DC組為0.183±0.074、對照組為0.185±0.026、空白組為0.176±0.053，致敏DC組刺激指數顯著高于其它三組，差異有顯著性(P＜0.01)。 3經FCM檢測，胃癌細胞抗原致敏DC主要刺激人外周血T淋巴細胞增殖為CD8+表達陽性的CTL(60.58±8.43)％，顯著高于其它組，差異有顯著性(P＜0.01)。 4與未致敏DC組和對照組

13、相比，經胃癌細胞抗原致敏DC激活的T淋巴細胞對胃癌細胞的殺傷效應顯著增加，差異有顯著性(P＜0.01)。并且隨效靶比增加，殺傷效應亦顯著增加(P＜0.01)。 結論：自外周血中提取的PBMC，在體外培養(yǎng)擴增可獲大量T淋巴細胞。胃癌細胞抗原致敏DC可顯著刺激T淋巴細胞增殖為CD8+細胞毒CTL。胃癌細胞抗原致敏DC活化的特異CTL在體外具有高效殺傷胃癌細胞的作用。本研究為胃癌的免疫生物治療提供了新的治療途徑和實驗依據。 第

14、四部分樹突狀細胞活化的特異性CTL對人胃癌裸鼠移植瘤生長增殖的影響 目的：研究胃癌細胞抗原致敏DC活化的特異性CTL對人胃癌裸鼠移植瘤生長和增殖的影響，為DC應用于胃癌免疫治療提供理論和動物實驗依據。 方法：構建人胃癌裸鼠移植瘤模型，皮下注射胃癌細胞抗原致敏DC活化的特異CTL，測量移植瘤大小、重量，光鏡、電鏡觀察形態(tài)學變化，流式細胞術檢測移植瘤細胞G0/G1、S、G2/M期細胞比率及凋亡率，研究胃癌細胞抗原致敏DC活化

15、的特異CTL在體內對胃癌的作用。 結果1胃癌細胞抗原致敏DC活化的特異性CTL作用后裸鼠皮下移植瘤的體積和重量分別為(0.87±0.21)cm3、(1.03±0.24)g，明顯小于非抗原特異CTL組和對照組，差異有顯著性意義(P＜0.01)。 2裸鼠人胃癌移植瘤形態(tài)學觀察：光鏡和透射電鏡觀察抗原特異CTL組瘤組織細胞出現不同程度的壞死、退變，還可見瘤細胞表現不同程度的體積縮小，與鄰近的瘤細胞脫離，細胞核皺縮、核碎裂，核碎

16、片有膜包裹等凋亡形態(tài)學改變。 3胃癌細胞抗原致敏DC活化的特異性CTL作用后裸鼠皮下移植瘤細胞的增殖值數為24.39±2.46％，顯著低于非抗原特異CTL組(31.24±3.85％)和對照組(32.78±4.17％)，P＜0.01；而凋亡細胞比率為15.83±2.77％，顯著高于非抗原特異CTL組(7.28±2.26％)和對照組(9.15±1.33％)，(P＜0.01)。 結論：應用具有高侵襲轉移特性的人胃癌OCUM-2