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文檔簡介
1、目的:
本研究采用過氧化氫(H2O2)誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vascular endothelial cells,HUVEC)損傷,建立HUVEC氧化損傷模型,觀察黃芩莖葉總黃酮(SSTF)對氧化損傷HUVEC的保護作用,并探討其機制。
方法:
1.HUVEC氧化損傷模型的建立;
體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC),用H2O2誘導HUVEC損傷。
2、實驗分:正常對照組(normal control),H2O2損傷1-9組(濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2、4、5、8、10mmol/L),損傷時間定為4小時、8小時,采用倒置顯微鏡觀察不同濃度H2O2對HUVEC形態(tài)學變化的影響。測定損傷時間為4小時正常對照組、H2O2損傷組(H2O2濃度分別為0.5、1、2、4mmol/L)各組細胞活力(MTT法),測定細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)的活性。
2.SSTF對H
3、UVEC氧化損傷的保護作用及其機制的研究;
實驗分①正常對照組;②H2O2損傷組(H2O2濃度為2mmol/L);③-⑤依次為SSTF低、SSTF中、SSTF高濃度組:在培養(yǎng)液中先加入終濃度為100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L的SSTF孵育24小時,再加入2mmol/L的H2O2誘導損傷:⑥陽性對照VC組:在培養(yǎng)液中先加入終濃度為20 mg/LVC孵育24小時,再加入2mmol/L的H2O2誘導損傷。4小
4、時后終止培養(yǎng),MTT法測定各組細胞活力(OD值),測定各組細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)的含量、超氧化物岐化酶(SOD)活性;流式細胞儀檢測正常對照組、H2O2損傷組、SSTF高濃度組、VC組細胞的凋亡率;以及采用western-blot法測定各組細胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達情況。
結(jié)果:
1.HUVEC氧化損傷模型的建立;
1.1、倒置顯微鏡觀察不同濃度H2O2對H
5、UVEC形態(tài)學的影響;
損傷時間達到8小時,H2O2低濃度組細胞損傷很明顯,濃度稍高時,細胞損傷嚴重,細胞變圓、腫脹,細胞膜邊緣模糊不清,較多細胞脫落死亡。因而我們最終選擇了損傷時間為4小時。此條件下,0.1mmol/L和0.2mmol/L H2O2損傷組與正常組相比,細胞形態(tài)并無明顯區(qū)別,0.5mmol/L和lmmol/L H2O2損傷組與正常組相比,細胞形態(tài)稍有區(qū)別,但是細胞損傷尚不明顯。2mmol/L H2O2損傷組
6、,與正常組比較,細胞形態(tài)有明顯變化,細胞有些變形,但細胞邊界尚清楚。4mmol/L H2O2損傷組細胞變形明顯,胞膜邊緣不清晰,有較多細胞脫落。
1.2、不同濃度H2O2對HUVEC氧化損傷的影響;
①各濃度H2O2損傷組與正常對照組相比細胞活力(OD值)均有統(tǒng)計學差異(P<0.01);②0.5mmol/L、lmmol/L H2O2損傷組與正常組比較,LDH活性差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),2mmol/L
7、、4mmol/L H2O2損傷組和正常組相比,LDH活性差異統(tǒng)計學意義顯著(P<0.01)。
2.SSTF對HUVEC氧化損傷的保護作用及其機制的研究
2.1、保護作用
①除SSTF低濃度組與H2O2損傷組比較,細胞活力(OD)值差異無統(tǒng)計學意義外(P>0.05),其它兩組藥物組與H2O2損傷組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01);②SSTF各濃度組細胞培養(yǎng)液中LDH活性均明顯低
8、于H2O2損傷組(P<0.05或P<0.01)。
2.2、保護機制;
①SSTF各濃度組細胞培養(yǎng)液中MDA含量明顯低于H2O2損傷組(P<0.05或P<0.01);②SSTF各濃度組細胞培養(yǎng)液中SOD活性均明顯高于H2O2損傷組(P<0.05或P<0.01);③SSTF組細胞凋亡率明顯低于H2O2損傷組(P<0.01);④H2O2損傷組Bcl-2蛋白表達水平明顯低于正常組(P<0.01),SSTF各濃度組Bc
9、l-2蛋白表達水平明顯高于H2O2損傷組(P<0.01)。
結(jié)論:
1.H2O2體外誘導HUVEC氧化損傷模型的建立:2mmol/LH2O2作用4小時,為適合本實驗研究的最佳條件。
2.SSTF可對抗H2O2,提高細胞活力,降低LDH的活性,從而對氧化損傷的HUVEC起到保護作用。
3.SSTF對氧化損傷HUVEC的保護機制可能與對抗自由基,降低脂質(zhì)過氧化物MDA的含量、增加SOD
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