縫隙連接介導血管緊張素Ⅱ促進樹突狀細胞免疫激活參與動脈粥樣硬化形成研究.pdf

1、本課題共分為三個部分。 第一部分：血管緊張素Ⅱ促進樹突狀細胞縫隙連接蛋白43的表達及縫隙連接通訊的形成 研究目的：本部分研究探討血管緊張素(angiotensin，Ang)Ⅱ對樹突狀細胞(dendriticcell，DC)中縫隙連接蛋白(connexin，Cx)43的表達、DC與DC細胞間縫隙連接通訊的建立、DC表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和抗原遞呈分子主要組織相容性復合物(majorhistocompat

2、ibilitycomplex，MHC)—Ⅱ的表達和DC對T淋巴細胞激活能力的影響，試圖進一步闡明AngⅡ促進免疫炎癥反應加速動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的具體機制。 研究方法：采用培養(yǎng)的C57BL/6小鼠骨髓來源的DC，以10-6mol/LAngⅡ處理5、15、30、60分鐘，及以不同濃度(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)處理30分鐘，或經AngⅡ10-6mol/L、LPS10

3、0ng/ml、AngⅡ+LPS處理或用10-5mol/L纈沙坦(Valsartan，Val)預處理30分鐘后再加入AngⅡ+LPS干預24小時或5×10-5mol/L庚醇(Heptanol，Hep)預處理30分鐘后加入AngⅡ干預24小時，以免疫印跡法檢測DC細胞中Cx43的表達，劃痕標記免疫熒光示蹤技術觀察DC細胞間縫隙連接通訊的形成，流式細胞術檢測DC表面CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表達，混合淋巴細胞反應檢測DC對T淋

4、巴細胞的激活能力． 結果：AngⅡ呈濃度依賴性的促進Cx43的表達，10-6mol/LAngⅡ作用最強(相對表達量：0.51±0.03versusControl0.234±0.03，P＜0.05)，在作用30分鐘時達最大效應(相對表達量：0.594±0.08versus0min0.194±0.05，P＜0.01)，1小時時仍有刺激作用；LPS能顯著促進Cx43的表達(相對表達量：0.784±0.03versusControl0.

5、40±0.06，P＜0.01)，AngⅡ增強LPS的促進作用(相對表達量：1.01±0.08versusLPS0.78±0.03，P＜0.05)，AT1受體拮抗劑纈沙坦則抑制這種增強作用(相對表達量：0.69±0.09versusAngⅡ+LPS1.01±0.08，P＜0.01)；AngⅡ能顯著增強DC細胞間的縫隙連接通訊，這種作用被纈沙坦抑制，被庚醇完全取消；AngⅡ促進DC刺激T淋巴細胞增殖的作用不明顯(SI：1.45±0.15ve

6、rsusControl1.05±0.10，P＞0.05)，但能增強LPS活化的DC對T淋巴細胞的刺激能力(SI：3.91±0.19versusLPS3.15±0.21P＜0.01)，這種增強作用被AT1受體拮抗劑纈沙坦抑制(2.84±0.17versusAngⅡ+LPS3.91±0.19，P＜0.01)，而庚醇則取消了二者的作用(1.81±0.13versusAngⅡ+LPS3.91±0.19，P＜0.01)。 本部分研究結果表

7、明，AngⅡ能促進DC表達Cx43，增強LPS誘導的Cx43在DC的表達并促進DC細胞間縫隙連接通訊的建立，AngⅡ還能增強LPS誘導的DC對T淋巴細胞的激活能力，但是AngⅡ對DC表面CD40、CD80、CD86和MHC—Ⅱ的表達影響不明顯，提示AngⅡ對DC的成熟和有效激活可能主要起協(xié)同作用，其具體分子機制和在體持續(xù)作用條件下對DC的影響有待進一步研究。 第二部分：血管緊張素(1-7)增強血管緊張素Ⅱ誘導的DCERK1/2的

8、磷酸化 研究目的：本部分研究探討DC是否具備完整的腎素—血管緊張素系統(tǒng)(renin—angiotensinsystem，RAS)，AngⅡ對DC中與DC表面CD40、CD80，CD86和MHC—Ⅱ的表達有密切關系的絲裂原激活蛋白激酶(mitogen—activatedproteinkinases，MAPK)活化的影響和通過的途徑以及Ang—(1-7)對AngⅡ介導的DC中MAPK細胞信號轉導通路的作用。 研究方法：應用逆

9、轉錄—聚合酶鏈式反應法(reversetranscription—polymerasechainreaction，RT—PCR)檢測小鼠骨髓來源樹突狀細胞(bonemarrow—deriveddendriticcell，BMDC)中血管緊張素轉化酶2(angiotensin—convertingenzyme—relatedcarboxypeptidase，ACE2)和Ang—(1-7)受體MasmRNA的表達；小鼠BMDC經Ang—(1

10、-7)、纈沙坦(valsartan，Val)、PD123319和D—Ala7—Ang—(1-7)預處理后加入AngⅡ，然后收集細胞以免疫印跡法檢測細胞中MAPK的激活。 研究結果：1、小鼠BMDC有ACE2和Mas受體mRNA的表達，其表達量與小鼠心肌細胞的表達量相當；2、AngⅡ(5min，10-7mol/L)迅速刺激細胞外信號相關激酶(extracellularsignal—relatedkinase，ERK1/2)磷酸化(

11、相對表達量：0.46±0.09versus0min0.24±0.04，P＜0.05)，這種效應能被AngⅡ1型(AngⅡtype1，AT1)受體拮抗劑纈沙坦部分抑制(相對表達量：0.72+0.05versusAngⅡ0.91±0.13，P=NS)，而幾乎被AngⅡ2型(AngⅡtype2，AT2)受體拮抗劑PD123319完全取消(相對表達量：0.52±0.08versusAngⅡ0.91±0.13，P＜0.01)；3、Ang—(1-7

12、)可單獨誘導ERK1/2的磷酸化(相對表達量：0.57±0.05versuscontrol0.35±0.04，P＜0.01)，Ang—(1-7)與AngⅡ共同作用則顯著增強ERK1/2的磷酸化(相對表達量：1.20±0.20versusAngⅡ0.91±0.13，P＜0.05)，這種增強作用能被Ang—(1-7)受體拮抗劑D—Ala7—Ang—(1-7)消除(相對表達量：0.63±0.07versusAngⅡ+Ang—(1-7)0.95

13、±0.08，P＜0.01)；4、Ang—(1-7)和AngⅡ對p38和c—JunN—terminalkinase(JNK)的磷酸化均無影響。 本部分研究結果表明：1、DC配備有完整的RAS系統(tǒng)；2、AngⅡ通過AT2受體刺激小鼠BMDC細胞中ERK1/2的磷酸化；3、Ang—(1-7)能增強這種作用。DC產生的Ang—(1-7)可通過該途徑在局部拮抗AngⅡ的致炎作用。 第三部分：內源性血管緊張素Ⅱ促進動脈粥樣硬化斑塊內

14、樹突狀細胞表面縫隙連接蛋白43的表達及其成熟 研究目的：本部分研究擬建立內源性高AngⅡApoE—/—小鼠動物模型，探討在體持續(xù)作用情況下AngⅡ對AS斑塊中DC表面Cx43及成熟標志物之一CD40的表達，以及對AS發(fā)生發(fā)展的影響。 研究方法：采用兩腎一夾(twokidneyoneclip，2K1C)方法建立內源性高AngⅡApoE—/—小鼠動物模型，其中一組予AT1受體拮抗劑纈沙坦(valsartan，Val)4mg/

15、kg.d-1灌胃，并設假手術組(sham)，喂養(yǎng)10周后有創(chuàng)法測動脈血壓，放射免疫法檢測血漿中腎素活性和AngⅡ濃度，油紅O染色觀察斑塊負荷，抗SMCα—actin染色觀察斑塊纖維帽狀態(tài)及斑塊穩(wěn)定性，免疫組化雙染色法檢測斑塊中DC細胞Cx43和CD40表達。 結果：模型建立成功，2K1C組ApoE—/—小鼠血壓顯著升高(MBP：122±6mmHgversussham88±3mmHg，P＜0.05)，Val4mg/kg.d-1灌胃

16、對升高的血壓無影響(MBP：123±5mmHgversussham88±3mmHg，P＜0.01：versus2K1C122±6mmHg，P=NS)。2K1C組ApoE—/—小鼠動脈AS斑塊負荷顯著重于sham組，2K1C+Val組斑塊負荷明顯較2K1C組輕；2K1C組ApoE—/—小鼠動脈AS斑塊呈不穩(wěn)定形態(tài)，sham組和2K1C+Val組斑塊則呈穩(wěn)定斑塊形態(tài)；2K1C組小鼠斑塊中DCCx43、CD40表達顯著增高，而2K1C+Val