17β-雌二醇對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：觀察17β-雌二醇（E2）對(duì)由氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）凋亡的影響及其影響機(jī)制，旨在探討雌激素抑制動(dòng)脈粥樣硬化和減少女性冠心病的可能機(jī)制。過(guò)去有關(guān)雌激素對(duì)EPCs影響的研究多著重于促進(jìn)EPCs增殖遷移和血管生成方面，而對(duì)EPCs凋亡方面則重視不夠。本實(shí)驗(yàn)使用ox-LDL作為誘導(dǎo)劑來(lái)觀察E2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的前體EPCs凋亡的影響。由于ox-LDL在動(dòng)脈粥樣硬化（AS）中的重要地位，因此雌激素抑制由

2、ox-LDL誘導(dǎo)的凋亡更能說(shuō)明其抗AS作用。本研究還就E2對(duì)抑制凋亡的機(jī)制和途徑進(jìn)行觀察，即觀察E2是否通過(guò)其受體起作用，是否與PI3K/Akt途徑有關(guān)。 方法：①外周單個(gè)核細(xì)胞的分離：肝素抗凝抽取人外周血50ml（肝素1000U）。PBS對(duì)倍稀釋，按1：1加在人淋巴細(xì)胞分離液上，2000R/min離心，吸取中間白膜層單個(gè)核細(xì)胞，1500R/M離心洗滌三次，取細(xì)胞懸液與等體積2g/L臺(tái)盼藍(lán)混合，進(jìn)行細(xì)胞活力計(jì)算（死細(xì)胞-藍(lán)色、活

3、細(xì)胞不著色），活細(xì)胞數(shù)占98%以上可進(jìn)行接種。以上在抽取血樣后四小時(shí)內(nèi)完成。②誘導(dǎo)分化：纖連蛋白用PBS溶解稀釋為1 ng/ml后包被24孔板，每孔中加入100ul，置于37℃溫箱中孵育2h，臨用前吸出多余的液體，用PBS洗滌兩次。分用M199培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度，接種于培養(yǎng)瓶中，成纖維細(xì)胞多于24小時(shí)內(nèi)貼壁，因此培養(yǎng)24小時(shí)后取未貼壁細(xì)胞以4×106/c㎡密度接種于包被有纖維連接蛋白（FN）的24孔培養(yǎng)板（每孔M199培養(yǎng)液1 ml），

4、添加10%胎牛血清、1%青鏈霉素（1萬(wàn)單位/ml）、VEGF50 ng/ml、 b-FGF1 ng/ml，置于5%CO2、飽和濕度、37℃孵育箱中培養(yǎng)四天，用磷酸鹽緩沖液洗掉非貼壁細(xì)胞，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至7d，進(jìn)一步用PBS洗掉非貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)用。③EPCs鑒定：利用免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞表抗CD34及VEGFR-2；利用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞表抗CD133；用EPCs特異性抗體Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行

5、免疫熒光染色。④EPCs調(diào)亡的觀察：采用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的Annexin-v、碘化丙錠（PI）雙染色免疫熒光法檢測(cè)EPCS的凋亡。貼壁細(xì)胞直接用蓋玻片來(lái)培養(yǎng)7d后，用PBS洗滌兩次，在500ul的Binding Buffer中加入2ul異硫氰酸熒光素標(biāo)記的Annexin-v、5ul PI混勻。將上述溶液加于蓋玻片表面，使長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片表面均勻覆蓋，避光，室溫反應(yīng)10分鐘。將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下雙色濾光片觀察。⑤E2對(duì)

6、EPCs凋亡的觀察：用不同濃度E2干預(yù)經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)凋亡的EPCs，觀察其劑量依賴性及時(shí)間依賴性。⑥機(jī)制研究加入雌激素受體阻斷劑ICI182，780及PI3K抑制劑LY294002后觀察凋亡的影響。 結(jié)果：⑴E2對(duì)EPCs的自然凋亡有抑制作用，100 nmol/L濃度E2作用下的凋亡率為（8．23±0．6）%，與空白對(duì)照組（12．31±0．34）%的凋亡率相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01）。⑵E2抑制ox-LDL誘導(dǎo)的E

7、PCs凋亡具有劑量依賴性。在E2濃度10nmol/L-100 nmol/L范圍內(nèi)隨著其濃度的增加，在干預(yù)24h后檢測(cè)，其抗凋亡的作用逐漸增強(qiáng)。在10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L濃度E2下凋亡率依次為（22．39±0．68）%、（20．42±2．56）%、（13．93±0．3）%，與ox-LDL誘導(dǎo)組（31．43±1．05）%的凋亡率比較，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01）。在干預(yù)48h后檢測(cè)凋亡率依次為（23

8、．28±0．64）%、（19．25±1．16）%、（14．57±0．45）%，與24h結(jié)果的比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。⑶雌激素受體阻斷劑ICI182，780與PI3K抑制劑LY294002能夠明顯抑制E2的抗凋亡作用，加入雌激素受體阻斷劑ICI182，780組的凋亡率上升至（28．6±1）%，加入PI3K抑制劑LY294002組的凋亡率上升至（25．2±1）%，與E2組（13．9±0．3）%的凋亡率相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<