aFGF預(yù)防失神經(jīng)支配運(yùn)動(dòng)終板退變及肌萎縮的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、如何預(yù)防運(yùn)動(dòng)終板退變及肌萎縮已成為當(dāng)前臨床運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損傷后功能重建過(guò)程中急需解決的難題。迄今對(duì)運(yùn)動(dòng)終板退變的預(yù)防研究甚少,治療方法不多。臨床常用的方法是提倡功能鍛煉,但其只能避免肌肉廢用不能提供神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、且外科修復(fù)病例早期常需固定肢體而無(wú)法開(kāi)展,作用有限。曾經(jīng)有學(xué)者提出電刺激可以替代失神經(jīng)肌肉的興奮性,并提出了實(shí)驗(yàn)鼠模擬正常運(yùn)動(dòng)終板興奮的電刺激模式,取得了一定的效果,但電刺激作用不能持久,并有諸多不便。近年在藥物實(shí)驗(yàn)研究方面取得了一些成果

2、:有作者報(bào)道大鼠腹腔注射地塞米松可以減緩減輕非離斷性神經(jīng)損傷支配運(yùn)動(dòng)終板的退變;口服氨哮素可以防止失神經(jīng)支配運(yùn)動(dòng)終板的退變,防止肌肉萎縮,其作用可能是通過(guò)某種途徑使肌衛(wèi)星細(xì)胞產(chǎn)生一種胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)模仿神經(jīng)對(duì)肌肉的營(yíng)養(yǎng)作用；此外,神經(jīng)斷端間應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)可減輕運(yùn)動(dòng)終板的退變；1996年,Margaret等報(bào)道在Ⅱ期修復(fù)神經(jīng)的同時(shí)將酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)纖維蛋白凝膠植入

3、其支配的萎縮肌腹,初步研究可以誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)終板的再生,但對(duì)不修復(fù)神經(jīng)者無(wú)明顯作用,其結(jié)果僅僅說(shuō)明aFGF的作用是在修復(fù)神經(jīng)的前提下,沒(méi)有說(shuō)明能否保護(hù)失神經(jīng)支配的運(yùn)動(dòng)終板,也沒(méi)有探討其對(duì)功能恢復(fù)效果的作用。
　　 aFGF具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng),如促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化,促進(jìn)組織修復(fù),也是一種形態(tài)發(fā)生因子；其靶細(xì)胞有成肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等；在重建神經(jīng)肌肉接頭時(shí)能激活靜止的未分化神經(jīng)靶細(xì)胞形成基底膜,有促進(jìn)血管生成改善微循環(huán),對(duì)

4、多種組織有體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)作用。成纖維細(xì)胞有促進(jìn)肌細(xì)胞基底膜形成的作用,而骨胳肌基底膜是神經(jīng)肌肉接頭形成的重要條件,因此,aFGF促進(jìn)成纖維細(xì)胞的分化對(duì)神經(jīng)肌肉接頭的形成具有重要作用；很多研究表明肌肉萎縮的因?yàn)橹饕羌∧な艿讲煌潭鹊闹愡^(guò)氧化作用,這一因素也將累及運(yùn)動(dòng)終板,因此,促進(jìn)基底膜的形成有助于補(bǔ)充受損的膜性結(jié)構(gòu)。亦有研究表明aFGF能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的流出與流入過(guò)程,有利于促進(jìn)黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤氧化酶,從而有力于自由基的清除而保

5、護(hù)膜性結(jié)構(gòu)如運(yùn)動(dòng)終板。此外,對(duì)成肌細(xì)胞的促進(jìn)分化可以形成肌細(xì)胞并分化成肌管,有助于防止肌肉萎縮；作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞有助于改善血循環(huán)。
　　 aFGF對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損傷后運(yùn)動(dòng)終板退變及肌萎縮的預(yù)防是否有作用尚無(wú)報(bào)道,本研究試圖探討aFGF對(duì)失神經(jīng)支配運(yùn)動(dòng)終板退變及肌萎縮的預(yù)防作用及其作用機(jī)理。
　　 研究目的:
　　 1、建立為失神經(jīng)支配運(yùn)動(dòng)終板及肌肉提供替代性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的aFGF緩釋系統(tǒng)。
　　 2、建立aFG

6、F纖維蛋白凝膠預(yù)防失神經(jīng)支配運(yùn)動(dòng)終板退變及肌萎縮的動(dòng)物模型。
　　 3、探討aFGF纖維蛋白凝膠預(yù)防失神經(jīng)支配運(yùn)動(dòng)終板退變及肌萎縮的形態(tài)學(xué)及機(jī)能學(xué)效果。
　　 4、初步探討aFGF纖維蛋白凝膠預(yù)防失神經(jīng)支配運(yùn)動(dòng)終板退變及肌萎縮的作用機(jī)理。
　　 材料和方法:
　　 1、纖維蛋白凝膠復(fù)合aFGF緩釋系統(tǒng)的制備:
　　 2、制做動(dòng)物模型及分組:155只成年純系Sprague-Dawley大鼠在全麻(1

7、0％水合氯醛腹腔注射)下切斷右側(cè)腓總神經(jīng)脛前肌分支(距神經(jīng)入肌點(diǎn)約1cm),隨機(jī)分為5組:修復(fù)神經(jīng)植入aFGF組(NR+aFGFgel):縫合神經(jīng)外膜+脛前肌植入aFGF纖維蛋白凝膠(aFGF25μg/只)；修復(fù)神經(jīng)植入凝膠組(NR+gel):縫合神經(jīng)外膜+脛前肌植入纖維蛋白凝膠；未修復(fù)神經(jīng)植入aFGF組(aFGFgel):脛前肌植入aFGF纖維蛋白凝膠(aFGF25μg/只)；單純修復(fù)神經(jīng)組(NR):縫合神經(jīng)外膜；未修復(fù)神經(jīng)未植入組(

8、Blank):神經(jīng)肌肉不做處理。NR+gel、NR、Blank為三個(gè)對(duì)照組。術(shù)后觀察6周。
　　 3、形態(tài)學(xué)研究:采用肉眼形態(tài)學(xué)檢查觀察肌肉的外觀形態(tài),測(cè)量脛前肌濕重,采用氯化金法染色顯示運(yùn)動(dòng)終板,采用超薄切片、鉛鈾染色、透射電鏡觀察運(yùn)動(dòng)終板超微結(jié)構(gòu),統(tǒng)計(jì)各組運(yùn)動(dòng)終板均數(shù)及其退變率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。觀察aFGF纖維蛋白凝膠在體內(nèi)的降解及異常反應(yīng)。
　　 4、機(jī)能學(xué)研究:采用Karnovsky-Roots亞鐵氰化銅法顯示運(yùn)

9、動(dòng)終板乙酰膽堿酯酶(AchE),觀察各組運(yùn)動(dòng)終板AchE變化情況。
　　 5、機(jī)理研究:采用超薄切片、鉛鈾染色、透射電鏡觀察各組運(yùn)動(dòng)終板附近脛前肌肌衛(wèi)星細(xì)胞的形態(tài),每例隨機(jī)觀察20個(gè)超薄切片視野,統(tǒng)計(jì)肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用免疫組織化學(xué)染色檢查aFGF受體(aFGFR)表達(dá)部位；統(tǒng)計(jì)每例aFGFR陽(yáng)性血管表達(dá)率；圖像分析儀測(cè)量毛細(xì)血管壁內(nèi)aFGFR平均灰度。
　　 6、試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS13.0

10、軟件包(第一軍醫(yī)大學(xué)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(計(jì)量資料采用One-WayANOVA進(jìn)行分析,多重比較采用LSD法；計(jì)數(shù)資料采用R×C表資料的x2檢驗(yàn)進(jìn)行分析),差異顯著性水準(zhǔn)置于0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1、肉眼形態(tài)學(xué)檢查:NR+aFGFgel組:自身對(duì)照可見(jiàn)兩側(cè)脛前肌對(duì)稱且無(wú)明顯肌萎縮,肌張力正常；NR+gel組及NR組表現(xiàn)相近:右側(cè)脛前肌明顯萎縮,肌張力下降；aFGFgel組:右側(cè)脛前肌略有萎縮,

11、但不如NR+gel組及NR組明顯,肌張力消失；Blank組:右側(cè)脛前肌明顯萎縮,肌張力消失。NR+aFGFgel組、NR+gel組、aFGFgel組纖維蛋白凝膠植入局部組織無(wú)異常反應(yīng)。
　　 2、脛前肌濕重:NR+aFGFgel組脛前肌濕重為1.26±0.10g,aFGFgel組脛前肌濕重為1.20±0.12g,兩組脛前肌濕重高于三個(gè)對(duì)照組,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性意義。
　　 3、終板染色檢查:NR+aFGFgel組可見(jiàn)運(yùn)動(dòng)

12、終板結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)正常:NR+gel組及NR組表現(xiàn)相近:失神經(jīng)肌纖維上的終板形態(tài)不規(guī)則,軸索終末分支減少而雜亂,終板呈細(xì)條狀或點(diǎn)狀；aFGFgel組:未見(jiàn)軸突,運(yùn)動(dòng)終板形態(tài)大致正常,但區(qū)域縮小。Blank組:未見(jiàn)軸突,運(yùn)動(dòng)終板數(shù)量明顯減少,形態(tài)不規(guī)則。
　　 4、電鏡檢查:NR+aFGFgel、aFGFgel組運(yùn)動(dòng)終板的數(shù)量較多,容易辨認(rèn),結(jié)構(gòu)基本正常,運(yùn)動(dòng)終板退變例數(shù)少。三個(gè)對(duì)照組運(yùn)動(dòng)終板數(shù)量減少,結(jié)構(gòu)退變,運(yùn)動(dòng)終板退變例數(shù)多

13、。
　　 5、神經(jīng)低頻重復(fù)電刺激檢查:NR+aFGFgel組所有大鼠神經(jīng)低頻重復(fù)電刺激時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)大的肌電波波幅衰減反應(yīng),衰減率為5.70±3.13％,沒(méi)有出現(xiàn)陽(yáng)性情況；NR+gel、NR組大鼠低頻電刺激時(shí)出現(xiàn)較大的肌電波波幅衰減反應(yīng),陽(yáng)性率均為90％。NR+aFGFgel組衰減率低于對(duì)照組,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性意義。
　　 6、運(yùn)動(dòng)終板AchE活性:NR+aFGFgel、aFGFgel組運(yùn)動(dòng)終板染色深,顯示Ache活性強(qiáng),

14、結(jié)構(gòu)接近正常,NR+aFGFgel組AchE染色面積為1693.98±168.16μm2,灰度為24.81±1.44,aFGFgel組AchE染色面積為1520.60±303.00μm2,灰度為24.93±1.54,AchE活性高于對(duì)照組,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性意義。
　　 7、肌衛(wèi)星細(xì)胞觀察:NR+aFGFgel、aFGFgel組肌衛(wèi)星細(xì)胞體積增大,數(shù)量多。NR+aFGFgel組MSC數(shù)量為11.00±3.00,aFGFgel組M

15、SC數(shù)量為10.40±1.14,MSC數(shù)量高于對(duì)照組,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著意義。
　　 8、免疫組織化學(xué)檢查:aFGFR陽(yáng)性部位主要定位在毛細(xì)血管壁內(nèi),NR+aFGFgel、aFGFgel組顯示毛細(xì)血管aFGFR表達(dá)密度高,毛細(xì)血管密集,對(duì)照組毛細(xì)血管aFGFR表達(dá)密度低,毛細(xì)血管稀少。
　　 結(jié)論：
　　 1、實(shí)驗(yàn)證實(shí)aFGF纖維蛋白凝膠可做為失神經(jīng)支配運(yùn)動(dòng)終板及肌肉提供替代性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的藥物緩釋系統(tǒng),未見(jiàn)異常反應(yīng)。

16、
　　 2、聯(lián)合神經(jīng)修復(fù)及應(yīng)用aFGF纖維蛋白凝膠可明顯減輕大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損傷后運(yùn)動(dòng)終板退變,減輕肌萎縮。
　　 3、即使神經(jīng)未及時(shí)修復(fù),應(yīng)用aFGF纖維蛋白凝膠可有效保護(hù)大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損傷后所支配的運(yùn)動(dòng)終板、減輕肌萎縮。
　　 4、神經(jīng)重復(fù)電刺激檢查神經(jīng)肌肉間傳導(dǎo)功能表明:運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損傷后聯(lián)合神經(jīng)修復(fù)及應(yīng)用aFGF纖維蛋白凝膠保護(hù)運(yùn)動(dòng)終板可有效改善神經(jīng)肌肉接頭間傳導(dǎo)。
　　 5、酶組織化學(xué)檢查運(yùn)動(dòng)終板AchE

17、活性表明:運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損傷后應(yīng)用aFGF纖維蛋白凝膠保護(hù)運(yùn)動(dòng)終板可有效維持運(yùn)動(dòng)終板AchE活性,有利于神經(jīng)遞質(zhì)的正常代謝,有利于神經(jīng)沖動(dòng)的正常傳遞。
　　 6、應(yīng)用aFGF纖維蛋白凝膠處理組MSC數(shù)量高于對(duì)照組,說(shuō)明aFGF纖維蛋白凝膠預(yù)防運(yùn)動(dòng)終板退變及肌萎縮的作用與aFGF促M(fèi)SC增殖作用有關(guān)。
　　 7、應(yīng)用aFGF纖維蛋白凝膠處理組運(yùn)動(dòng)終板附近分布了較多毛細(xì)血管,微循環(huán)良好；而未經(jīng)aFGF纖維蛋白凝膠處理的運(yùn)動(dòng)終板附近

18、毛細(xì)血管稀疏,微循環(huán)較差；說(shuō)明aFGF具有明顯的促血管形成及改善微循環(huán)作用。
　　 8、應(yīng)用aFGF纖維蛋白凝膠處理組運(yùn)動(dòng)終板附近毛細(xì)血管aFGFR表達(dá)陽(yáng)性率及表達(dá)量高于未經(jīng)aFGF纖維蛋白凝膠處理組,進(jìn)一步說(shuō)明aFGF纖維蛋白凝膠預(yù)防運(yùn)動(dòng)終板退變及肌萎縮的途徑在于其作用于毛細(xì)血管,改善運(yùn)動(dòng)終板附近微循環(huán),彌補(bǔ)失神經(jīng)支配肌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。
　　 9、本實(shí)驗(yàn)通過(guò)肌衛(wèi)星細(xì)胞及運(yùn)動(dòng)終板附近微循環(huán)的形態(tài)觀察提示給運(yùn)動(dòng)終板及肌肉人