沙棘原花青素的分離、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性研究.pdf

1、沙棘(Hippopha(e)rhamnoides)是我國蒙醫(yī)、藏醫(yī)的習(xí)用藥材,已有千余年的歷史,大量的研究結(jié)果表明:沙棘在其果子、葉片、種子、樹皮中含有多種營養(yǎng)活性成分,具有抗癌、抗氧化、抗輻射、抗血栓、增強(qiáng)肌體活力和免疫力、消炎、抑菌、止痛和促進(jìn)組織再生的功效。人們對(duì)于沙棘中維生素C、類胡蘿卜素、黃酮、脂肪和多糖等成分在生理和藥理方面的活性研究較多。然而,沙棘作為原花青素的新資源,無論是其化學(xué)結(jié)構(gòu)還是其生物活性的系統(tǒng)研究均鮮見報(bào)道,因

2、此沙棘中原花青素的深入研究將對(duì)沙棘資源的深度開發(fā)和利用具有重要的理論和實(shí)際意義。
　　 本課題綜合運(yùn)用了色譜及波譜等現(xiàn)代分離、分析技術(shù)和化學(xué)分析方法,對(duì)沙棘莖皮中原花青素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析與鑒定,同時(shí)采用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、生物學(xué)技術(shù)和手段,著重研究了沙棘原花青素的體外抗氧化活性和體內(nèi)抗胃潰瘍作用,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1.沙棘中原花色素的含量測(cè)定和提取純化
　　 對(duì)沙棘各部分原

3、花色素含量進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果顯示沙棘籽和莖皮的含量較高,其中沙棘籽的含量高達(dá)9.67％,莖皮中的含量為4.42％。以沙棘籽為原料,比較了提取劑、溫度、pH值等因素對(duì)沙棘籽原花色素(以下簡稱SBPAs)提取效果的影響,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,確定了最佳提取條件:以65％的乙醇水溶液作為提取劑,提取溫度21℃,pH5.1,料液比為1:10,提取三次,每次90min。提取得率為5.10％。
　　 通過對(duì)16種樹脂的動(dòng)態(tài)吸

4、附與靜態(tài)吸附試驗(yàn)的比較,以D3520大孔吸附樹脂用于沙棘籽原花色素提取物的純化為宜,30％乙醇洗脫液中原花色素的含量達(dá)到96％以上,回收率為30％。
　　 2.沙棘莖皮中原花青素B3的結(jié)構(gòu)鑒定
　　 對(duì)沙棘莖皮提取物經(jīng)D3520大孔吸附樹脂純化得到的30％乙醇洗脫液(SBPC)進(jìn)行NP-HPLC和RP-HPLC-MS分析,結(jié)果表明,SBPC中含有原花青素單體(兒茶素和表兒茶素)以及至少含有三種二聚體和三聚體,其對(duì)應(yīng)分子量

5、分別為290,578,866。
　　 采用Toyopearl HW-40S凝膠色譜以100％甲醇洗脫SBPC,得到四個(gè)組分(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ)。其中組分Ⅰ經(jīng)NP-HPLC和RP-HPLC-MS分析為一單峰,因此命名為CompoundⅠ,DAD分析顯示其具有典型的原花青素特征光譜圖。負(fù)離子模式分析得到的準(zhǔn)分子離子的m/z為577,對(duì)應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜碎片為289和425,為典型的B型二聚體的特征碎片。通過過量間苯三酚存在條件下的酸水解,得

6、到的末端單元經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)為兒茶素,進(jìn)一步采用一維和二維核磁共振波譜的分析,鑒定該化合物是2個(gè)兒茶素通過C4-C8鍵連結(jié)的原花青素二聚體B3。
　　 3.SBPC和B3的抗氧化活性研究及比較
　　 本文通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn),研究了SBPC對(duì)羥自由基、紅細(xì)胞溶血、肝臟與肝線粒體中的脂質(zhì)過氧化以及肝線粒體腫脹度的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SBPC能夠有效地清除羥自由基,抑制脂質(zhì)過氧化,保護(hù)生物膜,減少紅細(xì)胞溶血,減輕肝線粒體腫脹程度,提示

7、SBPC具有很強(qiáng)的抗氧化能力。
　　 采用CuSO4-Phen-VC-H2O2化學(xué)發(fā)光體系、鄰苯三酚一魯米諾發(fā)光體系、H2O2-魯米諾發(fā)光體系和CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA發(fā)光體系分別測(cè)定了SBPC和B3對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基、H2O2的清除效果及對(duì)DNA的保護(hù)作用,結(jié)果顯示二者均具有極強(qiáng)的抗氧化能力,進(jìn)一步提純后得到的單一組分B3的抗氧化活性高于混合物SBPC。
　　 4.SBPC對(duì)大鼠應(yīng)激性胃潰

8、瘍的預(yù)防作用研究
　　 以大鼠浸水束縛應(yīng)激建立急性胃潰瘍模型,造模前灌胃不同劑量的SBPC(50mg,100,150mg/kgbw)或Ranitidine陽性藥物(30mg/kgbw)。測(cè)定潰瘍指數(shù)、大鼠胃液中胃酸含量和胃蛋白酶活性、大鼠的血漿中血漿皮質(zhì)醇(Cor)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和大鼠血漿表皮生長因子(EGF)及NO水平等生化指標(biāo)；通過免疫組化的方法分析了胃粘膜組織中iNOS的表達(dá)；表皮生長因子受體(EGFR)及

9、細(xì)胞核增殖抗原PCNA的表達(dá)；采用原位末端標(biāo)記法檢測(cè)了胃粘膜上皮細(xì)胞的凋亡。透射電鏡觀察和分析了大鼠胃粘膜的超微細(xì)胞結(jié)構(gòu)。與對(duì)照組相比,高劑量組SBPC(150mg/kgbw)的潰瘍指數(shù)明顯降低(P<0.01)。SBPC能抑制胃酸的分泌(P<0.01),降低胃蛋白酶活性(P<0.01),及血漿中Cor、ACTH、NO的水平(P<0.01),同時(shí)能抑制粘膜中iNOS的表達(dá),及顯著升高血漿EGF的水平(P<0.05),降低血漿中NO的濃度(

10、P<0.01)；及NOS和iNOS的活力(P<0.05),使粘膜中的iNOS的表達(dá)降低(P<0.01),增強(qiáng)EGFR和PCNA的表達(dá)分別達(dá)到顯著和及顯著水平(P<0.01,P<0.05),凋亡指數(shù)也顯著降低(P<0.05)。研究顯示預(yù)先給予急性胃潰瘍大鼠150mg/kgbw SBPC,可以有效緩解應(yīng)激引發(fā)的胃粘膜損傷。這種作用的機(jī)理是復(fù)雜的,可能是SBPC通過調(diào)控ACTH、Cor的分泌來影響胃酸的分泌,這與超微細(xì)胞結(jié)構(gòu)的觀察相一致,也有

11、可能是SBPC通過調(diào)節(jié)EGF及EGFR和NO水平促進(jìn)大鼠的細(xì)胞增殖抑制細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的,這一結(jié)果也從PCNA的表達(dá)上調(diào)得到支持。
　　 5.SBPC對(duì)大鼠乙酸性胃潰瘍愈合的促進(jìn)作用
　　 通過漿膜下注射乙酸建立慢性胃潰瘍模型,造模后灌胃不同劑量的SBPC(50mg,100,150mg/kgbw)或(Ranitidine陽性藥物,30mg/kgbw)。治療7天后、14天后分別處死動(dòng)物。通過測(cè)定潰瘍指數(shù)和大鼠的血漿中EGF以

12、及免疫組化的方法測(cè)定第七天胃粘膜潰瘍組織周圍EGFR、PCNA的表達(dá),以及粘液中PAS染色陽性的比率,觀察了SBPC對(duì)大鼠乙酸性胃潰瘍的促進(jìn)作用。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,SBPC各劑量組的潰瘍指數(shù)明顯降低,均能迅速提高血漿中EGF的水平,同時(shí)SBPC高劑量組(150mg/kgbw)大鼠胃粘膜EGFR及PCNA的表達(dá)也顯著增強(qiáng)(P<0.01,P<0.05),且中性粘液的分泌量增加(P<0.01)。提示SBPC對(duì)大鼠乙酸性胃潰瘍的愈合促進(jìn)作