丙型肝炎病毒非結構蛋白5A激活Survivin基因的表達.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)的感染呈全球性分布，我國也屬于HCV感染流行區(qū)。HCV是慢性肝炎、肝炎后肝硬化的主要病因之一，并與原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)生關系十分密切。HCV非結構蛋白5A(NS5A)是HCVRNA復制的重要組成部分。HCVNS5A能通過多種途徑激活細胞內多種與細胞增殖有關的轉錄因子如NF-KB、STAT-3PCNA等并能抑制由TNF-a及p53誘導的細胞凋亡。Survivin是近年來發(fā)現的一種凋亡

2、抑制蛋白，是凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis IAP)中的新成員，也是迄今發(fā)現的最強的凋亡抑制因子，在人類幾乎所有惡性腫瘤中均有明顯的表達。 本研究利用細胞轉染技術瞬時轉染HCV NS5A表達質粒(p<'CNS5A>)，用免疫細胞化學染色方法檢測轉染HCV NS5A是否成功，再通過RT-PCR和Western-blotting檢測方法探討HCV NS5A對Survivin基因表達的影響，了解HCV

3、NS5A促進細胞增殖和抑制細胞凋亡雙重生物學效應的分子機制，探討HCV致原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)病機理。 方法： 1.HOV NS5A表達質粒鑒定：采用雙酶切方法將p<'CNS5A>質粒進行酶切，產物經1.0％瓊脂糖凝膠電泳。 2.質粒轉染：轉染前，在50ml培養(yǎng)瓶上種植5x10<'5>HepG2細胞，按美國生命技術公司提供脂質體Lipofectin2000轉染程序，將p<'CNS5A>、p<'DNM>或p<'Rc/C

4、MV>質粒導入細胞，24小時后換為10％胎牛血清培養(yǎng)基，72小時后收獲。 3.免疫細胞化學染色:免疫細胞化學法(ABC法)檢測HCVNS5A蛋白的表達，按說明書介紹的方法進行。 4.RT-PCR：按RNA提取劑Trizol試劑說明書，分別提取上述轉染細胞的總RNA，用DNase消化其中DNA雜質。取4ugRNA，用MMLV逆轉錄為cDNA進行PCR擴增，1％瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。 5.Western-blott

5、ing：取上述各種處理細胞lxl0<'6>個，冰凍PBS洗3次，加裂解液，收集全蛋白上清。取50ug全蛋白在不連續(xù)SDS-PAGE膠電泳分離，電轉移至纖維膜，免疫染色。 結果： 1．p<'CNS5A>質粒經酶切后，可得到預期大小的HCVNS5A酶切片段。 2．轉染p<'CNSSA>質粒組細胞內有HCV NS5A蛋白表達，呈現棕黃色顆粒，分布在細胞漿中，以胞核周圍最明顯。未轉染組和轉染p<'Rc／CMV>空質粒載體

6、組細胞內則無HCVNS5A蛋白表達。 3．利用基因轉染技術，將分別轉染HCV NS5A質粒和空質粒的肝癌細胞株HepG2，用RT-PCR檢測Survivin mRNA的表達。實驗組Survivin mRNA表達明顯高于空白載體組和空白對照組(P<0.05)，而空白載體組和空白對照組Survivin mRNA表達相似(P>0.05)，說明空質粒對Survivin mRNA表達無影響，主要是HCVNS5A激活SurvivinmRNA

7、表達。 4．利用基因轉染技術，分別將p<'CNS5A>質粒、p<'Rc／CMV>空質粒、p<'CNS5A>質粒+p<'DNM>質粒、p<'SNM>質粒瞬時轉染至肝癌肝細胞株HepG2，用RT-PCR檢測各轉染質粒的HepG2中Survivin mRNA的表達。結果表明，轉染p<'cNS5A>質粒組條帶明顯高于轉染p<'Re/CMV>空質粒組、轉染p<'CNS5A>+p<'DNM>質粒組、轉染p<'DNM>質粒組(P<0.05)，

8、說明HCVNS5A可能是通過NF—кB調節(jié)Survivin mRNA表達。 5．利用Western blotting檢測兩種瞬時轉染質粒的HepG2和未轉染質粒的HepG2中Survivin蛋白的表達。實驗組Survivin蛋白表達明顯高于空白載體組和空白對照組，說明HCVNS5A促進Survivin蛋白表達。 結論： 1．HCV NS5A表達質粒能成功轉染至肝癌肝細胞株HepG2中，表達HCV NS5A蛋白。