RNAi抑制黃斑部脈絡膜新生血管形成的實驗研究.pdf

1、研究背景:黃斑是人視覺最關鍵、最敏銳的部位，多種原因均可以導致黃斑部病變，如光損傷、炎癥、外傷、變性、腫瘤等等，?？芍虏豢赡孓D的視功能障礙。如:老年性黃斑病變(AMD)、病理性近視(PM)、息肉樣脈絡膜血管病變(PCV)和特發(fā)性脈絡膜新生血管(ICNV)等等，這些疾病引起眼底改變的病理基礎就是脈絡膜新生血管(CNV)的生成，若不加以干預治療，最終發(fā)展均會導致嚴重的視功能的損害，致盲率很高。黃斑部發(fā)生交性時，脈絡膜毛細血管層-Bruch'

2、s膜-視網膜色素上皮(RPE)以及視網膜外層的神經細胞均發(fā)生變性，直接導致視網膜組織細胞慢性缺氧、缺血而致使細胞變性、萎縮等，并使視網膜色素上皮、脈絡膜毛細血管基底膜以及Bruch's膜發(fā)生萎縮或增殖。由于脈絡膜微血管發(fā)生了病變，破壞了RPE的屏障功能和吞噬功能，從而破壞了對視網膜內層感光細胞的保護作用，嚴重影響視功能。黃斑變性的主要眼底表現(xiàn)為色素脫落或色素增殖、硬性及軟性玻璃膜疣(drusen)、滲出、水腫、出血以及最終脈絡膜新生血管

3、的形成(CNV)。
　　 在關于觸發(fā)CNV的眾多機制中，主要有血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素(Ang)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)及粘附因子(AM)等等，其中血管內皮生長因子與抗血管生成因子之間的失衡尤為重要。VEGF是一種分泌性蛋白質，它可以增加血管通透性，引發(fā)炎癥，誘發(fā)新生毛細血管生成。VEGF廣泛分布于人和動物體內的多種組織結構中，如大腦、肝臟、腎臟及眼部等等，其中在眼部視網膜毛細血管的周細胞、視網膜色素

4、上皮細胞和視網膜內皮細胞均存在VEGF，這對維持眼部血管完整性起了重要作用。在正常情況下，眼部組織中VEGF蛋白或VEGF蛋白的mRNA的表達水平很低，但是在缺血、缺氧、炎癥等應激情況下，VEGF的蛋白與mRNA的表達水平均會明顯增高，從而誘導病態(tài)的新生血管的形成。
　　 大量實驗研究證實，在機體組織新生血管的發(fā)生、發(fā)展過程中，VEGF起主要作用，VEGF的過度表達會促進新生血管的形成。因此，眾多的學者在研究針對黃斑部CNV的治

5、療藥物時，都不約而同的將VEGF作為潛在的治療目標，比如以VEGF適配子形式出現(xiàn)的哌格太尼（Pegaptanib）或者以抗VEGF抗體片段形式出現(xiàn)的蘭尼單抗(Ranibiumab)等。當前，針對VEGF的抑制劑，主要有以下這些:Pegaptanib、Ranibiumab、Bevacizumab、VEGF-trap、KH902等，雖然這些藥物對眼部的新生血管有顯著的抑制效果，然而這些治療方法也存在一些不可忽視的問題，主要體現(xiàn)在以下兩點:首

6、先由于病灶處局部微環(huán)境的病理變化導致VEGF持續(xù)分泌，而以上藥物玻璃體腔注射后不能長期在患部存在，即使應用了各種藥物緩釋技術，仍無法達到長期抑制.VEGF的需求;更為重要的是這些藥物與VEGF結合屬于抗原抗體反應，則必然有抗原抗體復合物的生成，由于這些復合物的代謝較為困難，可能存在加重drusen的危險。所以我們認為，抗VEGF藥物的作用主要在于局部中和病灶處產生的VEGF，而不能抑制病灶處VEGF因子的繼續(xù)生成，因而無法避免CNV的復

7、發(fā)，理論上來說，抑制VEGF的產生將比降解它更有利于CNV的治療。
　　 當前針對CNV的治療，除了上述的抗VEGF藥物，另一經典有效的治療方法就是光動力療法(photodynamic therapy, PDT)，維替泊芬-PDT于2000年正式被美國FDA批準用于治療黃斑區(qū)的CNV，此種方法是采取靜脈內注射光敏劑-維替泊芬，而后其與血管內低密度脂蛋白相結合，聚集在眼部病灶新生血管處，再用一種特定波長的激光照射眼底病灶，照射范圍

8、稍大于眼底血管造影檢查所確定的新生血管范圍，光敏劑受激光激發(fā)后可以把能量傳遞給周圍的氧，生成強活性的單態(tài)氧，單態(tài)氧和相鄰的生物大分子發(fā)生氧化反應，產生自由基等細胞毒性物質，并直接作用于CNV使之破壞，并促使局部微血栓的形成，從而使病灶處新生血管發(fā)生閉塞，最終導致新生血管萎縮。PDT可以有效的封閉視網膜脈絡膜的新生血管，雖對正常的視網膜組織基本沒有損傷，但可造成局部組織缺氧;PDT療法也有其局限性，只能封閉已經形成的新生血管，且病灶區(qū)治療

9、后有可能產生瘢痕。盡管PDT為CNV的治療提供了一個新的思路，然而同抗VEGF藥物一樣，也存在病變區(qū)CNV的復發(fā)問題。因此，治療并預防黃斑區(qū)CNV惡性發(fā)展的關鍵在于有針對性的降低VEGF的產生，從而抑制CNV的形成，以及改善視網膜和脈絡膜的微循環(huán)。
　　 隨著對眼部的新生血管相關因子的深入研究，基因治療成為目前較具潛力的眼部新生血管性疾病的治療對策，尤其是近10年來興起的核糖核酸干擾(RNAinterference，RNAi)技

10、術，不但為研究生物體的基因表達和調控等功能提供了新方法，同時也為眼部新生血管性疾病的研究、預防與治療開辟了新途徑、新領域。在基因治療方面，RNAi是沉默特定基因的強有力工具，被廣泛應用于各個研究領域。RNAi由一種小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)所介導，是引起生物細胞內特異同源靶基因轉錄后沉默的基因表達調控機制，普遍存在于各種生物體內。siRNA由21-23個核苷酸組成，為RNaseⅢ裂解外源或內源

11、性長的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNAs)分子所形成。在眼部新生血管性疾病的治療研究方面，以VEGF及其受體VEGFR為靶基因，對體外合成的siRNA或dsRNA進行，結果顯示，相應的siRNA可明顯降低VEGF或VEGFR的表達水平，減輕VEGF對新生血管形成的誘導作用，抑制眼部新生血管形成，但體外方法無法大量合成siRNA或dsRNA，而且siRNA不穩(wěn)定、細胞通透性差、需反復使用，使其應用受到極大限制

12、，無法普及應用。
　　 目前，激光誘導大鼠CNV模型是我們最常用的方法之一，而CNV制模成功的關鍵在于Bruch's膜的破裂:CNV是脈絡膜的新生血管通過破損的Bruch's膜生長入視網膜神經上皮層下，因此如果激光能量過低而不能擊穿Bruch's膜，或激光時功率過大，導致視網膜組織破壞而瘢痕化，都不能形成有效的CNV模型。目前通常是根據(jù)操作者的經驗（觀察激光斑有無出血、氣泡等）來判斷Bruch's膜是否被擊穿，因此CNV模型成功

13、率都不高。3D-OCT（光學相干斷層掃描）問世以來，為視網膜的疾病提供了一種全新的診斷指標，快速無創(chuàng)，且可清晰顯示包括Bruch's膜在內視網膜橫斷面各層結構，與傳統(tǒng)的時域OCT相比，頻域OCT具有高分辨率成像和實時動態(tài)的優(yōu)點，還能清楚的反映出CNV與視網膜神經上皮層及視網膜色素上皮層之間的結構關聯(lián)?？煞窭?D-OCT直視下引導激光誘導色素大鼠CNV模型，從而相比于傳統(tǒng)肉眼下CNV造模，顯著提高CNV模型制備的成功率呢？
　　

14、 本研究擬采用Long-Evans色素大鼠，以其VEGF的mRNA調控區(qū)為靶基因，構建能表達作用于調控區(qū)的長發(fā)夾dsRNA(long-hairpin RNA，lhRNA)的質粒，并注射至正常色素大鼠玻璃體腔內，然后對接受質粒注射的大鼠進行3D-OCT引導下激光誘導CNV，研究VEGF mRNA干擾質粒對CNV形成的抑制作用。研究玻璃體腔注射質粒后，能否在大鼠體內表達形成特異性的lhRNA，并觀察此質粒對大鼠CNV的形成是否有抑制作用，期

15、望通過沉默VEGF-mRNA的調控區(qū)來降低VEGF的產生，同時破壞mRNA的穩(wěn)定性，達到抑制眼部新生血管形成的作用。該方法能克服體外合成siRNA的諸多不足，為治療應用提供實驗與理論依據(jù)。同時，將為眼部新生血管性疾病的治療開辟新途徑，提供新思路和新方法。
　　 本課題從以下三個方面進行研究后得到如下結果和結論:
　　 第一部分:VEGF基因RNA干擾質粒的構建與鑒定
　　 目的:構建干擾大鼠血管內皮生長因子(va

16、scular endothelial growth factor,VEGF)基因RNA表達的重組質粒，為進一步研究該RNAi質粒在脈絡膜新生血管形成中的作用奠定基礎。
　　 方法:以Long-Evans大鼠VEGF為靶基因，以pcDNA3.1為質粒載體，設計3組針對VEGF基因的RNA干擾(RNA interference，RNAi)序列，應用基因重組技術克隆入載體pcDNA3.1中，重組質粒分別命名為pcDNA3.1-VEGF

17、-LH1、pcDNA3.1-VEGF-LH2和pcDNA3.1-VEGF-LH3，并用DNA直接測序法和雙酶切法鑒定構建的重組質粒。
　　 結果:DNA測序證實克隆入載體pcDNA3.1(-)中的序列正確，雙酶切、PCR結果顯示有目的片段的釋放，證實RNA干擾序列正確插入載體pcDNA3.1(-)。
　　 結論:成功構建針對VEGF基因的RNAi質粒pcDNA3.1-VEGF-LH1、pcDNA3.1-VEGF-LH2和

18、pcDNA3.1-VEGF-LH3，為進一步研究該RNAi質粒在脈絡膜新生血管形成中的作用奠定了基礎。
　　 第二部分:3D-0CT可視引導激光誘導色素大鼠CNv模型
　　 目的:在3D-OCT可視引導下，采用氪紅激光誘導色素大鼠脈絡膜新生血管(CNV)模型，觀察大鼠CNV模型成功效率。
　　 方法:24只Long-Evans大鼠隨機分2組，每組12只。均選取右眼為實驗眼，進行氪紅激光誘導大鼠CNV:A組為對照組

19、，非3D-OCT引導;B組為實驗組，即在3D-OCT可視引導下行激光誘導大鼠CNV模型。A組在視乳頭周圍1-2PD處予氪激光8點，激光時肉眼觀察到有氣泡產生或少量出血。B組在眼底激光光凝的同時，以3D-OCT同步掃描，選擇Bruch's膜被擊穿處光凝斑8點。光凝3周后行眼底照相、眼底血管造影檢查及3D-OCT檢查，比較兩組大鼠CNV模型的成功率。
　　 結果:光凝后3周，觀察到A、B兩組視網膜水腫均基本消退，可見灰白色激光斑、少

20、數(shù)出血斑周圍見黃白色滲出物，熒光素滲漏。其中A組可見57點出現(xiàn)Bruch's膜破裂、38點出現(xiàn)CNV，B組96點激光斑Bruch's膜均破裂、73點出現(xiàn)CNV。x2檢驗兩組有顯著性差異(P＜0.05)。Bruch's膜破裂與CNV出現(xiàn)率呈高度正相關，相關系數(shù)r=0.64。
　　 結論:成功誘導CNV模型的關鍵是Bruch's膜的破壞，3D-OCT直視下引導氪激光誘導為實驗性CNV模型能提高模型的成功率，也為進一步研究RNA干擾質

21、粒在色素大鼠脈絡膜新生血管(CNV)形成中的作用奠定基礎。
　　 第三部分:RNA干擾質粒對激光誘導色素大鼠CNV形成的抑制作用
　　 目的:驗證RNA干擾質粒對激光誘導大鼠脈絡膜新生血管(CNV)的形成是否有抑制作用。
　　 方法:24只Long-Evans大鼠隨機分2組，每組12只。均選取右眼為實驗眼，A組為空白對照組，在3D-OCT引導下行氪激光誘導CNV;B組為實驗組，右眼玻璃體腔注射RNA干擾質粒后，在

22、3D-OCT引導下行氪激光誘導CNV。在視乳頭周圍1-2PD處予氪激光光凝，激光同時3D-OCT同步掃描，選擇Bruch's膜被擊穿處光凝斑8點。光凝3周后行眼底照相、3D-OCT及眼底血管造影檢查，比較兩組大鼠CNV模型的成功率。
　　 結果:3周后，A組全部96點激光斑均出現(xiàn)Bruch's膜破裂、68點出現(xiàn)CNV，B組96點Bruch's膜破裂、19點出現(xiàn)CNV。x2檢驗兩組有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結論