與新的抗輻射相關(guān)蛋白AA12及CHK1相互作用蛋白的篩選.pdf

1、AA12基因是胡寶成等人用PCR選擇性抑制消減雜交方法篩選到的新的EST,后經(jīng)Dot blot和Northern blot驗證、并用RACE技術(shù)獲得了其全長基因,該基因在A1-5細(xì)胞中高表達(dá)而在B4細(xì)胞中低表達(dá).與B4細(xì)胞相比,A1-5具有非常強的抗輻射性并伴隨不同尋常的G<,2>延遲效應(yīng).我們將AA12與CHK1基因分別克隆到酵母雙雜交載體pGBKT7和pGADT7中,將重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母AH109與Y187中,在四缺平板SD/-Ade

2、/-His/-Leu/-Trp上檢測報告基因HIS3和ADE2的表達(dá)情況,β-半乳糖苷酶活性分析和α-半乳糖苷酶活性分析檢測lacZ和MEL1報告基因表達(dá)情況.研究發(fā)現(xiàn)AA12和CHK1在酵母細(xì)胞水平存在相互作用.但AA12基因是否對A1-5細(xì)胞表現(xiàn)出的不同尋常的表型起關(guān)鍵作用,以及它與CHK1相互作用的機制尚不清楚.為發(fā)現(xiàn)新的與AA12或CHK1相互作用蛋白,同時進(jìn)一步驗證這兩個蛋白之間的相互作用,我們用AA12與Chk1基因分別克隆

3、到酵母雙雜交載體pGBKT7中,將前列腺組織cDNA文庫插入到pACT2中,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌AH109,用同樣方法檢測報告基因HIS3、ADE2、lacZ和MEL1的表達(dá)情況.同時用免疫印跡(Western blot)方法檢測了AA12基因在酵母中的表達(dá)情況,結(jié)果表明,AA12基因能夠在酵母細(xì)胞中正確表達(dá).經(jīng)過反復(fù)驗證,以AA12為誘餌蛋白,共篩選得到30個陽性克隆,經(jīng)驗證得到兩個與AA12相互作用蛋白,序列測定結(jié)果顯示這兩個基因序列

4、相同,為同一克隆.BLAST檢索顯示此序列與已知的一種核糖體蛋白RPL41基因高度同源.而以CHK1為誘餌蛋白,共篩選得到102個陽性克隆,經(jīng)驗證得到四個與CHK1相互作用蛋白,測序鑒定結(jié)果其中有兩個為相同序列,故只獲得三個相互作用蛋白,經(jīng)BLAST檢索顯示這三個基因都與染色體基因組蛋白序列同源.該課題為進(jìn)一步研究新基因AA12的功能及其與CHK1的相互作用機制奠定了基礎(chǔ).這些蛋白與AA12和CHK1的相互作用還需進(jìn)一步證實,有關(guān)的作用