人膝骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨差異表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是影響老年人生活質(zhì)量的最常見的疾病之一，病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)表面軟骨的丟失、關(guān)節(jié)軟骨下骨的硬化、囊性變、關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成及關(guān)節(jié)內(nèi)組織的炎性病變；最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、活動(dòng)障礙。隨著人口壽命的延長及老年社會的到來，骨性關(guān)節(jié)炎已成為導(dǎo)致老年人功能障礙的重要疾病之一。隨之而來的醫(yī)藥費(fèi)用上漲，給很多家庭和社會帶來了巨大的精神壓力和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，世界衛(wèi)生組織為此成立了由眾多國家參與的骨與關(guān)節(jié)疾病治療小

2、組，并將2000-2010年的十年定為“骨與關(guān)節(jié)十年”。由于中國人口眾多，正逐漸步入老年社會。因此，骨關(guān)節(jié)炎將成為重要的公共衛(wèi)生問題。 骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與關(guān)節(jié)局部因素、全身因素和個(gè)體遺傳差異均有密切的關(guān)系，其病變特點(diǎn)是各種因素致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞激活，分泌炎性蛋白和酶類分子增加，以及炎性抑制因子的減少。在諸多的因素影響和作用下，使關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨下骨合成與降解失去平衡，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的軟化、纖維化、潰瘍，軟骨下骨的硬化

3、、骨囊腫，周圍骨贅形成。軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)，尤其是Ⅱ型膠原、蛋白多糖等的變化是導(dǎo)致軟骨喪失正常生物力學(xué)特性的直接原因。其中關(guān)節(jié)軟骨的降解和破壞可能與各種蛋白類酶的代謝變化有密切的關(guān)系。因此，關(guān)節(jié)軟骨的蛋白組成變化可能反映關(guān)節(jié)炎的病理生理過程。Ⅱ當(dāng)前，人類基因組計(jì)劃完成以后，人類基因組研究的重心正在由結(jié)構(gòu)向功能轉(zhuǎn)移，即進(jìn)入后基因組時(shí)代一以蛋白質(zhì)組學(xué)為主要研究目標(biāo)。基因是遺傳信息的載體，蛋白是基因功能的執(zhí)行體，基因的主要功能是通過其表達(dá)產(chǎn)

4、物-蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的。差異表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)其旨在運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段，通過比較正常和病理情況下細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)在表達(dá)數(shù)量、表達(dá)位置、修飾狀態(tài)上的差異，探尋疾病相關(guān)的特異蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)既可為疾病發(fā)病機(jī)制提供線索，也可作為疾病診斷的分子標(biāo)志物，還可作為治療和藥物開發(fā)的靶標(biāo)。因此，深入了解這些疾病特異蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，從而揭示疾病過程中全部蛋白質(zhì)的活動(dòng)規(guī)律，為多種疾病機(jī)理的闡明及治療提供理論根據(jù)和解決途徑，具有重要的理論和實(shí)際意義。我們

5、通過對手術(shù)時(shí)獲取的OA關(guān)節(jié)軟骨組織標(biāo)本，以不同實(shí)驗(yàn)參數(shù)，即蛋白質(zhì)裂解液體積比、蛋白質(zhì)沉淀提取等方法提取關(guān)節(jié)軟骨總蛋白質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用13cm，pH3-10的IPG膠條進(jìn)行第一相等電聚焦，12％的SDS-PAGE進(jìn)行第二向電泳分離蛋白后，用分析軟件對圖譜進(jìn)行分析。結(jié)果顯示在組織和蛋白質(zhì)裂解液的質(zhì)量體積比為1:10，用丙酮結(jié)合無水乙醇法清洗蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)上樣量100μg得到的關(guān)節(jié)軟骨總蛋白質(zhì)的雙向電泳圖像重復(fù)性好，顯示蛋白分離清晰，沒有明顯

6、的條帶。 在此基礎(chǔ)上，我們利用得到的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，對正常和OA關(guān)節(jié)軟骨提取總蛋白，并進(jìn)行雙向電泳分離，電泳后的凝膠用銀染和考染法進(jìn)行染色，圖像掃描后應(yīng)用Imaginemaster分析軟件對電泳圖譜進(jìn)行分析，建立正常和OA關(guān)節(jié)軟骨的蛋白質(zhì)差異表達(dá)圖譜。我們發(fā)現(xiàn)有差異表達(dá)變化的蛋白點(diǎn)有16個(gè)。在此基礎(chǔ)上，采用自動(dòng)凝膠采樣系統(tǒng)對差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)進(jìn)行自動(dòng)采集，應(yīng)用特異性的胰酶消化蛋白質(zhì)，酶解后的肽段采用線形離子阱-傅立葉交換離子回旋共振

7、質(zhì)譜儀(Linear Ion Trap-FourierTransform Ion Cyclotron Resonanace Mass Spectrometry，LTQ-FT-MS)進(jìn)行分析，對獲得的原始數(shù)據(jù)通過SEQUEST軟件搜索SWISS-PROT的人非冗余蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫．在16個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)中，鑒定了14個(gè)蛋白質(zhì)。這些鑒定的蛋白質(zhì)包括細(xì)胞能量代謝相關(guān)蛋白、信號傳導(dǎo)蛋白、軟骨基質(zhì)蛋白、氧化還原反應(yīng)酶、以及功能未能明確的蛋白。為

8、了保證初篩結(jié)果的可信及進(jìn)一步研究的確定性，并探討差異表達(dá)蛋白膜聯(lián)蛋白-I(Annexin A1，ANNX-I)在軟骨中的表達(dá)情況及在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，我們運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測ANNX-I在正常和OA關(guān)節(jié)軟骨中的相對含量。該步是下游差異蛋白功能分析的基礎(chǔ)。結(jié)果顯示，ANNX-I在正常關(guān)節(jié)軟骨中表達(dá)明顯，而在OA關(guān)節(jié)軟骨中低表達(dá)，或不表達(dá)。與我們雙向電泳的結(jié)果相符。 通過對以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，本文得出如下結(jié)論：