體外沖擊波對肌腱細胞增殖活性影響的實驗研究.pdf

1、目的：有關肌腱愈合機制的研究已有很多報道，由于在體內的研究受很多因素影響，因而已有不少的研究在體外進行。至今對肌腱細胞及成纖維細胞參與肌腱愈合的機制尚不完全清楚。自Dehm1971年體外培養(yǎng)雞胚肌腱細胞成功以來，對肌腱細胞的研究逐步深入，其生物學特性也逐步被認識。而體外沖擊波對于很多肌腱末端病來說是一種有效的、無創(chuàng)的方法，并取得很好的臨床效果，然而很多機制尚未清楚。本研究旨在應用激光共聚焦顯微鏡對細胞進行形態(tài)觀察以及通過對細胞增殖及對細

2、胞代謝物TGF-β、Ⅰ型膠原等的檢測，反應何種方式體外沖擊波能對肌腱細胞的具體代謝影響，為沖擊波質量肌腱末端疾病提供新的理論依據。
　　 方法：本研究取新西蘭大白兔后肢屈肌腱進行原代培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)后分為A組（ESW干預組）、B組（未干預組）；經最適能流密度（0.36mj/m㎡，200頻次）干預后，采用共聚焦顯微鏡熒光染色對其進行形態(tài)觀察；然后對其采用MTT比色法檢測A、B兩組不同時間點的OD值，比較細胞的增殖差異；在24小時、4

3、8小時、72小時、1周四個不同時間點應用ELISA法分別檢測細胞iNOs、MMP-1、Col-I的值；采用RT-PCR法結合光密度相對值半定量分析沖擊波干預后48小時Col-ImRNA表達量的差異。對上述各部分數(shù)據采用相應的統(tǒng)計學方法進行分析。
　　 結果：
　　 1.組織塊置入培養(yǎng)瓶后，倒置顯做鏡下觀察，最早第3天見組織塊周邊有腱細胞里放射狀爬出，與維織塊邊緣垂直，并向遠處貼壁生長，并呈圓形，具有折光性，最遲在第5天就

4、有細胞從組織塊周邊爬出；消化法培養(yǎng)的細胞，48h開始貼壁.后逐漸延展為梭形和多角形。在第10天左右細胞即融合成單層，細胞間的間隙非常小，可以傳代；在熒光染色核之后用共聚焦顯微鏡觀察，其密度大，有的地方細胞有疊加；從高倍視野中可以清楚的看出細胞長梭行的形態(tài)結構。傳代后干預組的細胞在細胞數(shù)量和形態(tài)上的發(fā)展均快于對照組，在用hoechst33342染核后的觀察中也發(fā)現(xiàn)干預組比空白對照組的密度高。72小時以后，細胞漸漸伸出偽足，成多角形。

5、>　　 2.MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，經ESW（0.36mj/m㎡，200頻次）干預后，在24小時、48小時、72小時、1周后4個時間段時間點均檢測其OD值，前3個時間點對照組均高于其余各時間點，具有顯著性差異（P<0.05），說明ESW干預對于肌腱細胞早期的增殖速度和數(shù)量都有明顯的促進作用；
　　 3.ELISA法檢測結果，A、B兩組細胞經ESW干預24小時、48小時、72小時、1周后4個時間段收集培養(yǎng)上清分別檢測細胞iNOs、MM

6、P-1、Col-I的值，各時間點（除1周時間點）對照組均高于實驗組，有顯著性差異（P<0.05）；
　　 4.Col-1mRNA的表達，ESW干預后48小時，A、B兩組均檢測到Col-1mRNA表達，后期表達均逐漸增強，A組明顯強于B組；肌腱膠原在整個生長過程中均表達，但是在ESW干預后48小時達到峰值，72小時后進入平臺期。
　　 結論：
　　 1、適當強度的ESW可促進肌腱細胞增殖；
　　 2、預實驗

7、對沖擊波干預的能級及頻次的篩選是實驗的關鍵步驟；
　　 3、體外沖擊波在早期對肌腱細胞代謝具有明顯的促進作用，iNOs、TGF-β等一系列表達產物明顯增強，從而促進了膠原蛋白的合成，初步證明了肌腱的早期愈合跟TGF-β等代謝物分泌增強有關，然而實驗也證實了在這些因子增加的同時MMP-1也在早期增加，可能在早期抑制細胞增長，而后期將對細胞的重塑發(fā)揮重要作用。
　　 4、本研究結果表明，體外沖擊波促進肌腱細胞增殖的原因可能是