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文檔簡介
1、研究目的:
1.以成年大鼠作為實驗對象,采取自膽總管逆行灌注膠原酶-V消化胰腺并用Ficoll進行梯度離心的方法獲取純化的胰島,檢測胰島的產量、純度、存活率及生物學活性,以確定胰島分離及純化方法是否適宜可靠。2.以胎鼠作為實驗對象,獲取其胰芽并通過膠原酶消化法取得原代細胞并進行純化后培養(yǎng),檢測干細胞相關標志物,確定胰腺干細胞的性質及分離和培養(yǎng)方法是否可靠。3.在胰腺干細胞傳統(tǒng)誘導培養(yǎng)基內加入胰島進行共培養(yǎng),觀察誘導分化效果
2、并檢測相關指標,探討其機制??傊?,通過以上研究,為胰腺干細胞移植治療糖尿病應用于臨床提供實驗支持和理論基礎。
研究方法:
第一部分:胰島的分離與純化。以成年Wistar大鼠為實驗對象,采取膽總管內逆行灌注膠原酶-V的方法消化胰腺,并將獲得的胰島懸液使用Ficoll溶液梯度離心進行純化。而后檢測所得胰島的產量、純度、存活率及培養(yǎng)液中基礎胰島素水平,并進行胰島素釋放試驗,計算胰島刺激指數。以判斷胰島分離提純方法是
3、否可靠。
第二部分:胰腺干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定。以胎鼠為實驗對象,取得其胰芽后以膠原酶消化法獲得原代細胞進行培養(yǎng),并采用差速貼壁的方法進行純化,取傳代后細胞行細胞角蛋白-19(CK-19)、巢蛋白(Nestin)、胰高血糖素(Glucogon)和胰島素(Insulin)等指標的免疫組織化學及RT-PCR檢測。以證實所得細胞的干細胞性質,并確定干細胞分離培養(yǎng)方法的可行性與可靠性。
第三部分:胰腺干細胞的誘導分
4、化。選取在第二部分中經檢測證實的胰腺干細胞進行誘導分化,實驗共分為三組:胰腺導管干細胞單獨培養(yǎng)組(I組),干細胞,胰島混合培養(yǎng)組(II組)及胰島單獨培養(yǎng)組(III組)。各培養(yǎng)組均采用相同的誘導培養(yǎng)基。共培養(yǎng)組在使用誘導培養(yǎng)基的同時加入50個/孔的胰島(直徑>100um)。在誘導培養(yǎng)過程中測定基礎胰島素水平,進行胰島素釋放試驗并計算胰島素刺激指數;誘導分化后再次檢測CK-19、Nestin、Glucogon和Insulin等指標,觀察胰腺
5、干細胞誘導分化后的成熟情況,評價混合培養(yǎng)組中胰島對于胰腺干細胞的促成熟作用,并研究其機制。
以上三部分數據以x±s表示,以SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。均數間采用t檢驗,重復測量數據以重復測量數據的方差分析檢驗,以P<0.05為檢驗水準。
結果:
第一部分:大鼠胰島的分離與純化。每只大鼠胰腺可獲得胰島細胞(345±38)個。經梯度離心純化后獲得(254±42)個胰島細胞,平均純度為(87±
6、l3)%,平均回收率為74.3%。AO/PI染色后顯示胰島制備物存活率大于95%。所得胰島培養(yǎng)24小時后基礎胰島素為4.21mIU/L,胰島素刺激指數為2.31。
第二部分:胰腺干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定。由胎鼠胰芽消化得到原代細胞,通過差速貼壁的方法純化后,可見細胞呈上皮樣貼壁生長良好,多邊形。通過免疫組織化學染色及RT-PCR檢測,結果示CK-19、Nestin和Glucogon在細胞內均有表達,誘導前細胞不表達Insu
7、lin。
第三部分:胰腺干細胞的誘導分化。誘導分化后,干細胞單獨培養(yǎng)組和干細胞-胰島共培養(yǎng)組中除CK-19、Ncstin和Glucogon繼續(xù)表達外,Insulin也開始表達。而且結果顯示,共培養(yǎng)組表達CK-19及Insulin蛋白的細胞陽性率高于干細胞單獨培養(yǎng)組,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
結論:
(1)經膽總管逆行灌注膠原酶-V并用Ficoll進行梯度離心純化的方法獲取胰島的產率、純
8、度高,存活率滿意,生物活性良好。(2)采用膠原酶消化法消化胎鼠胰芽組織,而后由差速貼壁法進行純化,是獲得胰腺干細胞的可靠方法。(3)自胎鼠胰芽獲得的細胞表達胰腺干細胞的相關標志物,在蛋白質及基因水平驗證了其干細胞性質。(4)傳統(tǒng)誘導培養(yǎng)基可誘導小部分胰腺干細胞分化為表達Insulin的相對成熟的B前體細胞。(5)誘導培養(yǎng)基中加入胰島后,可模擬胰腺內環(huán)境,通過多種因子作用促進胰腺干細胞成熟。(6)相關檢測提示,共培養(yǎng)后CK-19在胰腺干細
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