陽(yáng)離子脂質(zhì)體作為基因傳遞載體的研究進(jìn)展.pdf

1、基因治療對(duì)于糾正基因缺陷及治療后天獲得性疾病意義重大,將會(huì)引起此類(lèi)疾病治療的革命性變革。在此領(lǐng)域中,將目的基因遞送到靶細(xì)胞或組織的優(yōu)良載體是目前研究的一大熱點(diǎn)問(wèn)題,受到廣泛關(guān)注。但目前基因載體存在體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低、成本高的問(wèn)題,因此本課題的研究重點(diǎn)在于尋求價(jià)格低廉、體內(nèi)外高效轉(zhuǎn)染的新型基因傳遞載體,同時(shí)在制備方法上尋求創(chuàng)新。具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.基因傳遞載體材料的篩選及處方優(yōu)化
　　本研究創(chuàng)新性的利用Langmuir膜天

2、平對(duì)陽(yáng)離子脂質(zhì)材料雙十烷基二甲基溴化銨(BD10)、雙十二烷基二甲基溴化銨(BD12)和雙十八烷基二甲基溴化銨(DODAB),輔助性脂質(zhì)-膽固醇(Cholesterol,Chol)、膽固醇-琥珀酰-聚乙二醇(CHS-PEG1500)、單甲氧基聚乳酸-羥基乙酸(mPEG2000-PLGA8000)和OA進(jìn)行單分子膜和混合單分子膜性質(zhì)考察,以膜彈性作為評(píng)價(jià)指標(biāo),篩選出成膜效果最佳的陽(yáng)離子脂質(zhì)及最穩(wěn)定的混合分子膜,得到優(yōu)化的基因載體處方。

3、r>　　2.載體/DNA復(fù)合物制備
　　制備方法上創(chuàng)新性的先將陽(yáng)離子脂質(zhì)DODAB與DNA孵育,再輔以輔助性脂質(zhì)制得新型包含DNA的類(lèi)膠束DNA復(fù)合物。以制備方法、復(fù)合物粒徑、Zeta電位、外觀形態(tài)作為指標(biāo),評(píng)價(jià)新脂質(zhì)/DNA復(fù)合物制備方法的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)對(duì)薄膜分散法、注入法、稀釋法和反向蒸發(fā)法的考察,及不同溶劑、分散介質(zhì)和分散方法的比較,最終選取乙醇注入法作為載DNA復(fù)合物的制備方法。
　　3.載DNA復(fù)合物理化性質(zhì)的研究

4、r>　　常規(guī)方法制備的陽(yáng)離子脂質(zhì)體DODAB/Chol/OA粒徑為160.5nm,Zeta電位為57.8mV;新型制備方法得到的DODAB/CHS-PEG1500/OA粒徑為77.26nm,Zeta電位為16.7mV,DODAB/mPEG2000-PLGA8000/OA粒徑為85.62nm,Zeta電位為13.1mV。瓊脂糖凝膠電泳顯示DODAB/Chol/OA與DNA的質(zhì)量比為64/1時(shí),能與DNA完全結(jié)合;后兩者質(zhì)量比為4/1時(shí)可以

5、完全結(jié)合。
　　4.體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
　　采用自制基因載體及陽(yáng)性對(duì)照-Lipofectamine2000作為載體,轉(zhuǎn)運(yùn)雙報(bào)告基因pGL3-control和pRL-TK質(zhì)粒DNA,分別轉(zhuǎn)染NIH3T3、COS-7、MCF-7和B16細(xì)胞,同時(shí)考察了不同濃度血清對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。結(jié)果顯示,采用傳統(tǒng)方法制備的脂質(zhì)體能進(jìn)行有效的基因轉(zhuǎn)染,但對(duì)血清因素較為敏感;而新方法制備的基因載體對(duì)血清因素不敏感。
　　5.細(xì)胞攝取機(jī)制的研究

6、r>　　NIH3T3細(xì)胞對(duì)載DNA復(fù)合物的攝取實(shí)驗(yàn)表明,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基因載體主要通過(guò)細(xì)胞吞噬進(jìn)入胞內(nèi),同時(shí)也存在細(xì)胞融合現(xiàn)象。這為高效的體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染提供了理論支持。
　　6.基因載體的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
　　以NIH3T3、COS-7、MCF-7和B16細(xì)胞作為模型,評(píng)價(jià)基因載體的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明采用新方法制備的載體由于陽(yáng)離子成分少,同時(shí)載體/DNA復(fù)合物表面無(wú)強(qiáng)烈的正電荷存在,對(duì)細(xì)胞活性影響較小,因此未表現(xiàn)出明顯毒性。

7、>　　7.基因載體介導(dǎo)的siRNA干擾實(shí)驗(yàn)
　　自制基因載體包裹干擾HBV的siRNA,并轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞系,考察其抗乙肝病毒效果。結(jié)果顯示,所制備的基因載體能有效地將所載siRNA轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞,采用ELISA檢測(cè)到HBsAg被有效抑制,RT-PCR檢測(cè)到HBVDNA含量也明顯下降。表明自制基因載體能高效轉(zhuǎn)染細(xì)胞,發(fā)揮抗HBV效果。
　　8.載抗HBVsiRNA新型復(fù)合物的肝靶向性驗(yàn)證-活體成像<

8、br>　　為更好地發(fā)揮抗HBV效果,加入長(zhǎng)循環(huán)主動(dòng)肝靶向分子-半乳糖苷G20DE,采用Langmuir技術(shù)篩選處方,以?xún)?yōu)化后的處方包裹熒光染料-Cy5.5,用活體動(dòng)物成像技術(shù)驗(yàn)證載抗HBVsiRNA新型復(fù)合物的肝靶向性。結(jié)果表明該新型復(fù)合物有顯著肝靶向作用。
　　結(jié)論:本文對(duì)新型基因載體的組成、處方及制備方法進(jìn)行了系統(tǒng)研究,初步得到了轉(zhuǎn)染效率接近或高于商品化轉(zhuǎn)染試劑的體外轉(zhuǎn)染基因載體復(fù)合物,同時(shí)驗(yàn)證了載抗HBVsiRNA基因載體的