Neuregulin-1在缺血性再灌注腦損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、缺血性腦血管病(Ischemic Cerebral Vesscular Di sease，ICVD)是威脅人類健康與生存的主要疾病之一，是神經(jīng)科常見病多發(fā)病，致殘率極高，是目前重點防治的一種疾病。在ICVD的治療中重建血流或增強(qiáng)缺血區(qū)的血流供應(yīng)是缺血腦組織修復(fù)損傷的必需條件，但是血液再灌注后引起的神經(jīng)元再次損傷目前尚無有效的預(yù)防和治療手段。隨著ICVD的發(fā)病人數(shù)逐年增加，由此造成的死亡人數(shù)和病后致殘的人數(shù)也隨之上升。因此尋找安全有效的預(yù)

2、防和治療方法是當(dāng)務(wù)之急。 造成腦缺血的原因主要有兩個方面，一是由于腦動脈管腔狹窄或閉塞造成的該動脈所供應(yīng)的區(qū)域腦組織缺血；二是由于體循環(huán)障礙(如低血壓、心臟驟停、失血性休克等)引起的全腦缺血。由于不同的部位和不同的細(xì)胞對缺血的敏感性不同，所以缺血所致的損傷程度也不同。大腦較腦干敏感，皮質(zhì)較白質(zhì)敏感。在神經(jīng)細(xì)胞中，皮質(zhì)的Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ層神經(jīng)元、紋狀體神經(jīng)元以及海馬錐體神經(jīng)元最為敏感，當(dāng)發(fā)生缺血時首先受累。 在國內(nèi)外眾多的腦缺血

3、實驗動物模型中，最常用的是大腦中動脈線栓模型。該動物模型的優(yōu)點是可以準(zhǔn)確控制缺血再灌注時間，重復(fù)性、穩(wěn)定性和可靠性較高，實驗條件容易標(biāo)準(zhǔn)化。另外由于大鼠的腦血管結(jié)構(gòu)與人類相近，而且大腦中動脈為血栓好發(fā)部位，缺血性腦血管病多發(fā)生在大腦中動脈，所以大鼠大腦中動脈線栓法制作的局部腦組織缺血模型是模擬人腦缺血研究的理想模型。 腦缺血時缺血區(qū)神經(jīng)元壞死形成梗死灶，而在缺血區(qū)周圍神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡，并且血液再灌注時有會進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡，其

4、機(jī)制還不清楚，可能與腦缺血再灌注過程中產(chǎn)生的自由基、細(xì)胞因子和興奮性氨基酸以及鈣超載等都與細(xì)胞凋亡有關(guān)。因此神經(jīng)元凋亡是腦缺血損傷的主要病理生理機(jī)制之一。 Caspase是一類天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，大多數(shù)的細(xì)胞凋亡都依賴于caspase的激活，在細(xì)胞凋亡過程中具有十分重要的作用。其中caspase-3是caspase級聯(lián)反應(yīng)中一個關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶。體內(nèi)許多維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定的必需結(jié)構(gòu)蛋白、代謝和修復(fù)蛋白，經(jīng)激活的ca

5、spase-3酶解后，細(xì)胞的自我修復(fù)功能喪失而導(dǎo)致凋亡，如PARP，一種DNA修復(fù)酶，經(jīng)caspase-3水解后失去了修復(fù)DNA的能力。研究表明在腦缺血動物模型中，caspase-3蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)都明顯增強(qiáng)。側(cè)腦室給予caspase-3抑制劑能抑制caspase-3的活性，同時還能抑制神經(jīng)元的DNA斷裂，這些結(jié)果提示caspase-3的激活能促使腦缺血后神經(jīng)元的凋亡。 缺血后免疫炎性反應(yīng)是腦損傷加重的另一個重要機(jī)制。缺血

6、缺氧會激活膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量的細(xì)胞因子，腫瘤壞死因子(TNF-α)是其中一種重要的細(xì)胞因子。少量的FNF-α產(chǎn)生具有免疫介導(dǎo)、神經(jīng)修復(fù)等作用，而缺血狀態(tài)下產(chǎn)生的過量TNF-α則參與神經(jīng)元的損傷。大量的資料表明在腦缺血再灌注過程中，TNF-α在腦組織中的表達(dá)、腦脊液和血液里的含量都明顯增加。給予外源性TNF-α能引起梗死組織體積增加，而給予TNF-α拮抗劑或TNF-α受體阻斷劑都能有效地減輕腦損傷。因此抑制細(xì)胞因子引起的免疫反應(yīng)是治療和預(yù)防

7、腦缺血再灌注損傷的有效途徑。 Neuregulin—l(NRG-1)是一細(xì)胞-細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元產(chǎn)生，并通過ErbB受體酪氨酸激酶發(fā)揮生理功能。研究已證實NRG一1／ErbB信號通路在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起著重要的作用。NRG-1不僅能促進(jìn)神經(jīng)元的存活和神經(jīng)突起的生長以及膠質(zhì)細(xì)胞的生長和分化，而且能調(diào)節(jié)受體的表達(dá)(如乙酰膽堿受體、NMDA和GABA等受體)。ErbB受體包括ErbB2、ErbB3和ErbB4．，

8、由于ErbB3的激酶活性很低，而ErbB2的活化需要ErbB3和ErbB4的參與，因此，NRG-1的功能效應(yīng)可能主要通過ErbB4受體實現(xiàn)的。近年的研究顯示NRG-1／ErbB信號通路異常與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生有密切關(guān)系。在腦缺血損傷中，NRG-1在缺血組織周圍表達(dá)明顯增強(qiáng)并且外源性的NRG-1能抑制神經(jīng)元的凋亡、減小腦梗死的體積。在腦外傷動物模型中損傷側(cè)大腦皮質(zhì)中ErbB4受體的表達(dá)顯著上調(diào)，并認(rèn)為ErbB4的上調(diào)與神經(jīng)修復(fù)有關(guān)。在

9、腦缺血中ErbB4的表達(dá)變化還不未見文獻(xiàn)報道。越來越多的實驗結(jié)果表明NRG-l對神經(jīng)元的損傷具有保護(hù)作用。但NRG-1的保護(hù)機(jī)制還不清楚。基于以上的研究資料，我們推測NRG-1在預(yù)防和治療腦缺血再灌注損傷中有一定的臨床價值。為此我們在體外重組了人NRG-1蛋白，來研究它在腦缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制，為NRG-1應(yīng)用于臨床預(yù)防和治療提供實驗依據(jù)。本實驗采用SD大鼠大腦中動脈線栓法制作局部腦缺血動物模型，缺血90 min，再灌注24

10、 h。動物分為治療組(缺血前10 min給予NRG-13.0 ng/kg)、缺血組(給予同體積的生理鹽水)和假手術(shù)組。首先，我們應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察ErbB4受體表達(dá)的變化以及表達(dá)的細(xì)胞類型。NRG-1的神經(jīng)保護(hù)作用我們應(yīng)用行為學(xué)、TTC染色、TUNEL法觀察動物的行為表現(xiàn)、梗死體積及神經(jīng)元的凋亡。最后通過ELISA和RT-PCR方法分別觀察TNF-α和caspase-3 mRNA的表達(dá)來探討NRG-1的保護(hù)機(jī)制。實驗結(jié)果顯示ErbB4

11、受體在缺血側(cè)的大腦皮質(zhì)和紋狀體中的表達(dá)明顯上調(diào)，且在神經(jīng)元而非星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)。在大鼠腦缺血再灌注損傷中，NRG-1能改善動物的行為表現(xiàn)(平均表現(xiàn)得分由2.5±0.48減小到1.22±0.43)，減少腦梗死體積(由754.18±24.28mm<'3>減小到2l9.8±22.48mm<'3>)和抑制神經(jīng)元的凋亡，治療組左側(cè)皮質(zhì)比缺血組左側(cè)皮質(zhì)caspase-3 mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，與缺血組右側(cè)皮質(zhì)和假手術(shù)組比較無明顯差異。同樣治療組