GAM材料促進自體前交叉韌帶移植物愈合的體內外研究.pdf

1、用各種自體肌腱移植物替代重建前交叉韌帶即使經(jīng)過比較長的時間移植物和宿主之間也很難完全愈合，仍然存在自體肌腱移植物松弛和斷裂的嚴重并發(fā)癥。無論是采用自體還是異體移植物，在重建術后其愈合和再塑形過程都基本相似，都要經(jīng)歷移植物壞死、細胞重新移居、血管重建和再塑形四個階段。取半腱肌腱后觀察其再生時間，組織學及免疫組化結果證實，再生組織的確為新生肌腱，因其具有正常的腱細胞形態(tài)和腱組織結構，且主要成分由Ⅰ型膠原組成。雖然新生肌腱具有正常的組織結構，

2、但氨基葡聚糖和膠原的含量顯著低于正常腱組織，肌-腱連接處細胞排列紊亂無序，其直徑也明顯小于對側肌腱。雖然再生腱組織能夠將外力傳導通過肌-腱連接處，但其傳導速率明顯低于正常，最大抗牽拉力也只有正常的32％，生物學功能方面明顯弱于正常肌腱。
　　 研究表明，局部應用外源性細胞因子，可明顯增加韌帶的強度、剛度和抗拉斷能量。但由于細胞因子多為高分子蛋白，在生物內環(huán)境代謝快，生物利用度低，且有一定的免疫原性，這些缺點防礙了它在體內的局部應

3、用?；蛸|粒使細胞因子以DNA的形式儲存在載體中，不易受各類蛋白酶的水解，更穩(wěn)定，免疫原性更低，療效也更持久，可以在內環(huán)境中持續(xù)高水平地表達數(shù)周之久。傳統(tǒng)的基因轉染方法主要是將宿主體內的種子細胞取樣在體外培養(yǎng)一段時間，適當?shù)貍鞔笈c目標基因在體外轉染然后再回植體內，其工藝步驟，經(jīng)濟代價高昂，而且操作周期過長，不適合韌帶急性損傷修復的病理特點。
　　 近年來，一些提出“原位組織工程”的概念作為可能的解決方案，并且已成為基因治療和組

4、織工程的一個重要研究方向。原位組織工程的基本理念是將生物材料與質粒DNA相結合，形成一個基因局部釋放系統(tǒng)，即“基因活化基質”(gene activated matrix，GAM)，將該基質材料植入組織缺損處，當內源細胞爬入后，細胞被質粒轉染，分泌質粒編碼的組織修復蛋白因子，成為體內局部生物反應器，從而促進組織的重建，這種載有質粒DNA的生物材料，也被稱之為“局部基因釋放載體”(local gene delivery carrier)。<

5、br>　　 作者認為采用基因活化基質技術，通過較長期的動物實驗比較，從組織形態(tài)學和生物力學水平評價不同處理自體移植物的愈合轉歸，可為尋找優(yōu)化自體移植肌腱韌帶化的生物學新方法提供研究資料，從而降低前交叉韌帶重建術后自體移植物松弛斷裂的發(fā)生率，提高手術療效。
　　 目的:
　　 1、探討真核表達載體EGFP-N1-TGF-β1在成纖維細胞(GF)中的表達能力。
　　 2、完成兔前交叉韌帶重建動物模型的構建及鑒定，了

6、解GAM材料應用于動物模型后各時段肌腱移植物愈合的實際效能。
　　 3、了解兩組動物移植物愈合過程中的組織學形態(tài)變化，比較其膠原表達情況和細胞超顯微結構的差異性。
　　 方法:
　　 1、應用基因重組技術和限制性內切酶酶切構建并鑒定EGFP-N1-TGF-β1真核表達載體，體外培養(yǎng)兔成纖維細胞，傳代培養(yǎng)后以陽離子脂質體：EGFP-N1-hTGF-β1為3μL∶1μ g的比例轉染，G418篩選獲得穩(wěn)定轉染的細胞。通

7、過RT-PCR和熒光法檢測TGF-β1表達水平，利用水貂肺上皮細胞生長抑制法檢測TGF-β1的生物學活性。
　　 2、將新西蘭大白兔48只隨機分為兩組，試驗動物中，移植物與GAM材料作用者為實驗組(A組)，移植物未作處理者為對照組(B組)，每組動物樣本數(shù)24例。手術切除實驗動物的前交叉韌帶，制作脛骨及股骨隧道，取自體半腱肌作為肌腱移植物，引入骨隧道，兩端縫合固定，完成前交叉韌帶重建。術后1月、3月、6月分別處死動物取材。收獲肌腱

8、標本，大體觀察肌腱移植物的形態(tài)，標本用于生物力學測試，記錄最大斷裂負荷(負荷峰值)、斷裂時拉伸位移，應力、應變及彈性模量，并作出以上數(shù)據(jù)隨時間變化的關系圖譜。
　　 3、制備膝關節(jié)前交叉韌帶重建模型，實驗組給予生長因子，對照組給予鹽水，分別于術后1個月，3個月和6個月，將韌帶移植物取出，通過光學顯微鏡和電鏡進行肌腱組織學檢查，觀察其膠原表達和細胞超微結構的變化。
　　 結果:
　　 1、成功構建含EGFP-N1-

9、TGF-β1基因的真核表達載體，經(jīng)RT-PCR檢測了TGF-β1在轉錄水平mRNA的表達情況，熒光法檢測目標基因成功轉染至靶細胞，轉染后的成纖維細胞呈強陽性表達，并持續(xù)4周以上，轉染后細胞上清可有效的抑制水貂肺上皮細胞的生長。
　　 2、術后存活的動物，收獲標本時大體觀察無變異，僅發(fā)現(xiàn)對照組移植物斷裂1例，實驗組組未發(fā)現(xiàn)移植物斷裂，移植物的總體成功率為97.9％。在術后1個月時間段內，實驗組與對照組的各項力學指標差異無顯著性，在

10、術后3個月和6個月時，實驗組肌腱標本的最大斷裂負荷及彈性模量顯著大于對照組，p≤0.05，此時間段內各組的其它力學指標差異無顯著性。
　　 3、光學顯微鏡下見各時期對照組成纖維細胞數(shù)量較少且膠原纖維排列紊亂，實驗組成纖維細胞數(shù)量較多，膠原纖維成分增多，形狀粗大且排列較規(guī)則，接近正常組織結構。電鏡下見實驗組各時期實驗組的細胞內微結構較對照組有絲分裂活躍，出現(xiàn)代謝旺盛的成纖維細胞，纖維間隙內有較多基質成分，胞質中可見較為豐富的內質網(wǎng)

11、和線粒體。
　　 結論:
　　 1、重組真核表達載體構建正確，并能在成纖維細胞中表達TGF-β1mRNA，TGF-β1基因轉染可使成纖維細胞有效而穩(wěn)定的表達活性TGF-β1而產(chǎn)生生物效應。
　　 2、本實驗構建兔前交叉韌帶重建動物模型的手術方法與臨床實際情況相符，術后證實有很高的成功率，可用于前交叉韌帶愈合機制的實驗研究。GAM材料局部作用于肌腱移植物后，某些生物力學特性強于對照組，可提高目標肌腱的愈合強度。