辛伐他汀誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討膽固醇合成抑制劑辛伐他汀(Simvastatin，SIM)對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤(U251)細(xì)胞體外抗增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，并探討其可能的分子機(jī)制。 方法：選取人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測SIM不同濃度組(1、5、10、20、30、40、50、60μg/ml)、不同時(shí)間組(24、48、72、96h)對(duì)細(xì)胞存活和生長的影響情況，從而選擇適當(dāng)?shù)乃幬餄舛燃白饔脮r(shí)間。根據(jù)MTT的結(jié)果，設(shè)置對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組

2、(5、10、20μg/ml)。流式細(xì)胞術(shù)(flow cytomety，F(xiàn)CM)測定SIM對(duì)U251細(xì)胞周期分布和凋亡的影響，光學(xué)顯微鏡和Hoechst33258熒光染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。分別提取各組細(xì)胞總RNA，鑒定其完整性及含量，通過逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(reverstransCription PCR，RT-PCR)半定量檢測SIM處理前后U251細(xì)胞中SuⅣivin、Bax mRNAA的表達(dá)水平。采用流式細(xì)胞術(shù)半定量檢測SIM處

3、理前后U251細(xì)胞中Survivin及Bax蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1 MTT結(jié)果顯示：SIM(1、5、10、20、30、40、50、60μg/ml)對(duì)U251細(xì)胞具有抑制增殖的作用。不同濃度SIM處理細(xì)胞24-96h后，與對(duì)照組相比，各處理組OD值均有不同程度下降，差異具有顯著性(P<0.05)。且隨著SIM處理濃度的增大、作用時(shí)間的延長，OD值逐漸下降，即SIM對(duì)U251細(xì)胞的增殖抑制作用有明顯的劑量一效應(yīng)和時(shí)間

4、一效應(yīng)依賴關(guān)系。SIM處理細(xì)胞24、48、72、96h，IC50分別為19.25μg/ml、9.74μg/ml、5.75μg/ml、3.52μg/ml。 2 SIM作用U251細(xì)胞后，有明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞縮小，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞突起減少，胞體折光性減弱，胞漿內(nèi)可見有顆粒。隨SIM濃度和處理時(shí)間延長，細(xì)胞可變圓脫壁，部分細(xì)胞脹大破裂。同時(shí)可見到細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞皺縮破裂呈不規(guī)則形，在細(xì)胞周圍有放射狀分布的點(diǎn)片狀細(xì)胞

5、碎片，有的細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)空泡。隨著藥物濃度增加和作用時(shí)間延長，細(xì)胞破碎增多，培養(yǎng)液中可見到大量細(xì)胞碎片。熒光顯微鏡下觀察，10μg/ml SIM處理U251細(xì)胞2d后出現(xiàn)核固縮，DNA濃縮并向核膜靠近，核漿比例減小及胞膜皺縮等早期凋亡形態(tài)學(xué)變化；部分細(xì)胞因DNA斷裂，細(xì)胞核表現(xiàn)為片狀或點(diǎn)狀，出現(xiàn)凋亡小體。 3 流式細(xì)胞術(shù)檢測U251細(xì)胞周期分布和凋亡顯示，0、5、10、20μg/ml SIM作用U251細(xì)胞48h后，隨藥物濃度

6、增大，G<,0>/G<,1>期細(xì)胞逐漸增多；S期和G<,2>/M期細(xì)胞則逐漸減少。即SIM可阻滯U251細(xì)胞周期進(jìn)程于G<,0>/G<,1>期，該作用呈劑量一效應(yīng)依賴關(guān)系。0、5、10、20μg/ml SIM作用U251細(xì)胞48h、72h后，出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，依SIM濃度增大而逐漸升高；最大凋亡率為21.63％。流式細(xì)胞儀間接分析Survivin及Bax蛋白表達(dá)顯示，0、5、10、20μg/ml SIM作用U251細(xì)胞48h后，

7、Survivin的熒光指數(shù)H值隨處理濃度增大而逐漸減??；Bax的FI值隨處理濃度增大而逐漸增大。對(duì)于每一種蛋白，比較其處理組和對(duì)照組的FI值，差異具有顯著性(P<0.05)。 4 半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示：SIM處理前U251細(xì)胞Survivin、Bax基因均表達(dá)陽性。與對(duì)照組相比，經(jīng)SIM處理的U251細(xì)胞中SuⅣivin mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Bax mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)。經(jīng)SIM處理

8、48h后，2μg/ml組SuⅣivin/β-actin光密度比值由對(duì)照組的0.944±0.018降至0.237±0.009；BaX/β-actin光密度比值由對(duì)照組的0.219±0.015升至0.939±0.012。 結(jié)論： 1 本實(shí)驗(yàn)首次通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HMG-CoA還原酶抑制劑辛伐他汀(SIM)具有抗人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的作用，為人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供了新的理論依據(jù)。 2 SIM在一定濃度范圍內(nèi)，能夠

9、直接抑制U251細(xì)胞增殖，并呈時(shí)間一劑量依賴關(guān)系。 3 本實(shí)驗(yàn)證實(shí)SIM可阻滯U251細(xì)胞于G<,0>/G<,1>期并可誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡。 4 一定濃度的SIM能夠在mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平抑制U251細(xì)胞中Survivin表達(dá)、提高Bax表達(dá)。我們初步推論SIM通過下調(diào)SurvivinmRNA及蛋白的表達(dá)和上調(diào)Bax mRNA及蛋白的表達(dá)而發(fā)揮其抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用。 5 本實(shí)驗(yàn)揭