Tamoxifen誘導C6膠質瘤細胞凋亡及其分子機制的研究.pdf

1、目的： 比較Tamoxifen(TAM，他莫昔芬)對正常星形膠質細胞和C6膠質瘤細胞(C6細胞)凋亡的誘導作用及其可能的機制，為臨床應用TAM提供實驗依據(jù)。 試驗方法： 1.解剖顯微鏡下分離SD大鼠大腦皮質，用胰蛋白酶對組織進行消化，原代細胞培養(yǎng)7～10d后，37℃恒溫搖床，250rpm搖15～18h，去除脫落的細胞，繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細胞，并對培養(yǎng)的星形膠質細胞進行鑒定、細胞純度分析，以確定合適的傳代次數(shù)內使用細胞。

2、 2.不同濃度TAM處理C6細胞，通過MTT法、DNA ladder法、DAPI染色以及Western Blot等方法觀察TAM對C6細胞活性、凋亡以及PKCα/βⅡ磷酸化水平的影響。 3.體外培養(yǎng)的靜息狀態(tài)的正常星形膠質細胞和C6細胞分別給予不同濃度的TAM處理，通過DNA ladder法、Western Blot等方法同步觀察TAM對膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞凋亡以及PKCα/βⅡ磷酸化水平的影響。 結果：

3、 1.原代膠質細胞取材培養(yǎng)后，利用搖床使雜細胞脫落，用GFAP免疫熒光鑒定星形膠質細胞，DAPI復染細胞核。試驗結果證明機械振蕩法可以純化星形膠質細胞，但隨著細胞傳代，其它的雜細胞如成纖維細胞、小膠質細胞等生長迅速，使星形膠質細胞比例下降，因此，通過此法獲得的膠質細胞最佳使用時間是兩代以內的細胞。 2.TAM可引起C6細胞凋亡，呈濃度依賴性。當TAM濃度小于20 μM，作用24h時，C6細胞凝膠電泳未出現(xiàn)DNA階梯狀條帶

4、，當濃度大于20 μM時，呈現(xiàn)典型的DNA階梯狀條帶，并隨濃度增加DNA階梯狀條帶變得更加明顯。與C6細胞相比，正常星形膠質細胞組未出現(xiàn)DNA階梯狀條帶； 3.TAM可以引起C6細胞核形態(tài)的改變。經(jīng)TAM處理后，用DAPI染細胞核，當TAM濃度大于10 μ M，作用24小時，熒光鏡下可見C6細胞出現(xiàn)典型的凋亡特征：可見核固縮，染色質發(fā)亮，聚集呈團。 4.MTT法檢測結果顯示：當TAM濃度小于20 μM時，對C6細胞活性無

5、明顯抑制作用；TAM大于20 μM時，對C6細胞活性抑制作用呈明顯的時間和劑量依賴性。 5.Western Blot分析結果表明：TAM誘導C6細胞內PKCα/βⅡ磷酸化呈時間依賴性。TAM使正常大鼠星形膠質細胞和C6細胞內磷酸化PKCα/βⅡ均增加，但C6細胞磷酸化PKCα/βⅡ水平明顯高于正常細胞。 結論： TAM可抑制C6細胞活性和誘導凋亡，而PKCα/βⅡ信號傳導通路可能參與了TAM誘導的C6細胞凋亡作用