低頻低功率超聲誘導C-,6-膠質瘤細胞凋亡的初步研究.pdf

1、目的：探討低頻低功率超聲誘導大鼠C<,6>膠質瘤細胞(簡稱：C<,6>細胞，下同)凋亡，及其在誘導膠質瘤細胞凋亡中的作用機制。 方法： 采用MTT比色法、A0/EB雙染色法、TUNEL、流式細胞儀、電鏡技術等技術分析不同功率的低頻超聲誘導C<,6>細胞凋亡的作用。 (1)MTT比色法檢測不同功率的低頻超聲作用C<,6>細胞后Oh、6h、12h、24h和48h等時間點的OD值，計算生長抑制率，初步確定下一步實驗所需

2、超聲參數(shù)； (2)AO/EB雙染色法鑒別對照組和輻照各組凋亡/壞死/活C<,6>細胞，并計算細胞凋亡率和壞死率，最終確定實驗所需超聲參數(shù)； (3)TUNEL 法觀察對照組和輻照組C<,6>細胞的免疫學變化，并計算凋亡指數(shù)； (4)流式細胞儀分析對照組和輻照組C<,6>細胞的凋亡率(FITC-Annexin V/PI雙染法)，細胞周期及APR改變(PI單染法)； (5)透射及掃描電鏡觀察對照組和輻照組C<,

3、6>細胞超微結構的變化。 結果： (1)MTT比色法分析可見不同功率低頻超聲輻照C<,6>細胞后不同時間點細胞增殖均受到抑制，且呈劑量依賴性；由超聲輻照后0h、6h、12h、24h、48h時間點的IR值可見：1.75W/cm<'2>組、2.0W/cm<'2>組、2.5W/cm<'2>組輻照后6h對C<,6>細胞增殖抑制作用明顯，以下實驗均采用超聲輻照后6h作為觀察點。 (2)AO/EB雙染色法分析可見對照組僅有極

4、少數(shù)早期凋亡細胞，而輻照后各組凋亡細胞明顯增加。1.75W/cm<'2>組、2.0w/cm<'2>組、2.5W/cm<'2>組細胞凋亡率分別為17.9±0.65％、13.4±0.94％和12.5±0.67％，細胞壞死率分別為1.3±0.61％、8±0.54％和20±0.63％； (3)TUNEL法分析可見對照組僅有極少量棕黃色染色的凋亡細胞。而輻照組棕黃色染色的凋亡細胞明顯增多。與對照組相比較，輻照組的凋亡指數(shù)(AI)極顯著增加

5、(P<0.01)。 (4)流式細胞儀分析可見：與對照組相比較，輻照組的細胞凋亡率增加極顯著(P<0.01)；對照組細胞在正常二倍體DNA峰前未出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰(Ap峰，Apoptotic peak)，輻照組細胞則出現(xiàn)一明顯的亞二倍體凋亡峰；與對照組相比較，輻照組細胞的凋亡增殖比(APR)極顯著上調(P<0.01)。 (5)透射及掃描電鏡觀察可見：透射電鏡未見到對照組C<,6>細胞凋亡的超微結構改變，而輻照組C<,6>細

6、胞可見到凋亡各階段的改變，并可見典型的凋亡小體；掃描電鏡顯示對照組C<,6>細胞形態(tài)結構正常，細胞邊界清楚。輻照組C<,6>細胞形態(tài)結構正常，細胞膜有穿孔現(xiàn)象。 結論： 低頻低功率超聲輻照能抑制C<,6>細胞增殖，并具有劑量依賴性； 1.75W/cm<'2>的超聲輻照C<,6>細胞后繼續(xù)培養(yǎng)6h可獲得最高的凋亡率和最低的壞死率，是超聲誘導C<,6>細胞凋亡的最佳參數(shù)，當輻照功率繼續(xù)增加時，細胞凋亡率未繼續(xù)增加，而