FasL轉染人樹突狀細胞誘導T淋巴細胞凋亡的體外研究.pdf

1、南本人聲明，所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了論文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得南華大學或其他單位的學位或證書而使用過的材料。與我共同工作的同志對本研究所作的貢獻均已在論文中作了明確的說明。本人完全意識到本聲明的法律結果由本人承擔。作者簽名：17；I妙身1勿，D7年歲月矽日南華大學學位論文版權使用授權書本學位論文是本人在南華大學攻讀

2、——(博／碩)士學位期間在導師指導下完成的學位論文。本論文的研究成果歸南華大學所有，本論文的研究內容不得以其它單位的名義發(fā)表。本人同意南華大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權保留學位論文，允許學位論文被查閱和借閱；學?？梢怨紝W位論文的全部或部分內容，可以采用復印、縮印或其它手段保留學位論文；學?？筛鶕一蚝鲜∮嘘P部門規(guī)定送交學位論文。同意學校將論文加入《中國優(yōu)秀博碩士學位論文全文數據庫》，并按《中國優(yōu)秀博碩士學位論文全文

3、數據庫出版章程》規(guī)定享受相關權益。同意授權中國科學信息技術研究所將本學位論文收錄到《中國學位論文全文數據庫》，并通過網絡向社會公眾提供信息服務。對于涉密的學位論文，解密后適用該授權。作者簽名’印砂牟勿矽7年廠月加日導師簽名：1年瑚朋FasL轉染人樹突狀細胞誘導T淋巴細胞凋亡的體外研究研究生：陳專華導師：王毅教授摘要目的：轉染跏L基因的人樹突狀細胞(Dentrkicell，DC)與異系T淋巴細胞混合培養(yǎng)，觀察其對T淋巴細胞增殖和凋亡的影響

4、，探討髓L誘導免疫耐受的可能機制。方法：(1)密度梯度離心法獲得人外周血單個核細胞(Peripheralb100dmonouclcarceUs，PBMC)，經IL4、GMCSF和TNFQ等細胞因子擴增誘導為樹突狀細胞，流式細胞術(Flowcyomet巧，FCM)檢測DC表面分子CD40、CD80、CD86、HIADR和FasL的表達。(2)獲取人FasL基因(BC017502)，PCR擴增FasL基因，連接PCR產物至T載體中并送交測序

5、。取DNA序列完全正確的FasL片段將其亞克隆至真核表達載體pEGFP—N1上，XhoI，P吼I雙酶切鑒定，成功構建pEGFPN1鼢L。(3)脂質體法將pEGFPN1和pEGFP—N1脅L質粒分別轉染至DC，FCM檢測轉染后DC表面分子CD40、CD80、CD86、HIADR和FasL的表達；RTPCR檢測hFasLmRNA的表達。(4)將未轉染的DC、轉染pEGFPN1的DC和轉染pEGFPN1鼢L的DC分別與異系T淋巴細胞混合培養(yǎng)，

6、MTr法檢測DC對T淋巴細胞增殖的影響；FCM檢測DC誘導T淋巴細胞凋亡的能力。結果：(1)體外培養(yǎng)，獲得大量人外周血來源的樹突狀細胞，FCM檢測CD40、CD80、CD86、HI_ADR和FasL表達為5508278％，52222oo％，7554402％、76121233％和312072％。(2)F舔L基因PCR產物測序情況及FasL基因亞克隆至真核表達載體pEGFPN1后，XhoI，PStI雙酶切鑒定情況：可見擴增出的鼢L基因片段D

7、NA序列完全正確，XhoI，PstI雙酶切鑒定亞克隆FasL至pEGFPNI上正確，pECFP—N1FasL構建成功。(3)FCM檢測轉染pEGFP—N1和pEGFPN1FasL質粒后CD40、CD80、CD86、HLADR和FasL表達分別為5739258％、5194589％、7711364％、7612240％、415043％和5576263％，5083308％，7554402％、7609235％、3075117％。RTPCR證實轉染