低鹽脅迫下凡納濱對(duì)蝦消減cDNA文庫(kù)構(gòu)建及谷氨酰胺合成酶cDNA克隆和表達(dá).pdf

1、本研究采用抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)技術(shù)構(gòu)建了低鹽脅迫誘導(dǎo)下凡納濱對(duì)蝦肝胰腺消減cDNA文庫(kù)，對(duì)cDNA文庫(kù)中差異表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)進(jìn)行同源比對(duì)、功能分類(lèi)和鑒定分析，進(jìn)一步對(duì)文庫(kù)中差異表達(dá)的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)進(jìn)行了全長(zhǎng)克隆及序列分析，同時(shí)深入研究了低鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦GS的時(shí)空表達(dá)、GS活性、谷氨酰胺含量、血淋巴

2、氮代謝的影響。研究結(jié)果如下：
　　1.低鹽脅迫下凡納濱對(duì)蝦肝胰腺消減cDNA文庫(kù)構(gòu)建及差異ESTs分析
　　文庫(kù)中的克隆測(cè)序后獲得162個(gè)有效ESTs，經(jīng)CP3在線(xiàn)拼接后獲得21contigs和110singlets，共131個(gè)非重復(fù)序列。比對(duì)結(jié)果顯示，在131個(gè)非重復(fù)序列中，41個(gè)非重復(fù)序列與Genbank中的已知基因的序列有較高的同源性。
　　根據(jù)GO(geneontology)分類(lèi)法，所獲得的41個(gè)非重復(fù)序列共分

3、為7類(lèi)，分別為蛋白質(zhì)代謝及過(guò)程、碳水化合物代謝及能量產(chǎn)生、轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡、細(xì)胞防疫和體內(nèi)平衡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其他，所占比例分別為所占比例分別為27.5％、15.0％、17.5％、10.0％、12.5％、7.5％、10.0％。蛋白質(zhì)代謝及過(guò)程類(lèi)序列所占比例最高，其次為轉(zhuǎn)運(yùn)類(lèi)序列。
　　2.凡納濱對(duì)蝦谷氨酰胺合成酶的cDNA克隆及序列分析
　　本實(shí)驗(yàn)根據(jù)消減cDNA文庫(kù)中篩選獲得的GS EST設(shè)計(jì)特異性引物，采用cDNA末端快

4、速擴(kuò)增法成功克隆了凡納濱對(duì)蝦GS cDNA全長(zhǎng)序列，共計(jì)1455 bp，包括56 bp5’非編碼區(qū)，1101bp閱讀框以及298 bp3’非編碼區(qū)。閱讀框共編碼366氨基酸，分子量計(jì)算值為40.92 kDa，理論等電點(diǎn)為6.34，氨基酸序列有兩個(gè)模式位點(diǎn)，分別位于61-81 aa和243-259 aa。序列多重比對(duì)結(jié)果表明，凡納濱對(duì)蝦GS氨基酸序列有5處保守位點(diǎn)，與中國(guó)明對(duì)蝦同源性達(dá)93％、與眼斑龍蝦GS同源性達(dá)86％及與長(zhǎng)牡蠣同源性達(dá)

5、73％。采用NJ法構(gòu)建的GS系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，LvGS分類(lèi)地位處于無(wú)脊椎動(dòng)物支，與無(wú)脊椎動(dòng)物親緣性較近，與脊椎動(dòng)物親緣性較遠(yuǎn)。
　　3.低鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦GS表達(dá)量、活性、谷氨酰胺含量和氮代謝的影響
　　低鹽脅迫誘導(dǎo)下肝胰腺、腸、鰓和胃中GS mRNA表達(dá)量上調(diào)，心臟、肌肉和眼柄中GS mRNA表達(dá)量下調(diào)。低鹽脅迫下，肝胰腺中LvGS表達(dá)量先升高后下降，LvGS表達(dá)量在6h、12h、1d和2d顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；

6、肝胰腺中GS活性和谷氨酰胺含量有先升高后降低的趨勢(shì)，與對(duì)照組差異不顯著；血淋巴總蛋白和血氨有先降低后升高的趨勢(shì)，與對(duì)照組差異不顯著；血淋巴尿素氮有先升高后降低的趨勢(shì)，低鹽脅迫下3h和12h，血淋巴尿素氮顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；血淋巴尿酸有先升高后降低的趨勢(shì)，低鹽脅迫下3h、6h、12h、2d和3d，血淋巴尿酸顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。LvGS表達(dá)量、GS活性、谷氨酰胺含量、血氨、尿酸和尿素在低鹽脅迫下7d-30d趨于恢復(fù)正