建立cdna文庫時cdna的合成條件

1、<p>　　建立cDNA文庫時cDNA的合成條件</p><p>　　作者：黃寶成　陳志南　黃文晉　姜紹諄 </p><p>　　【關鍵詞】 cDNA合成 </p><p>　　關鍵詞: cDNA合成;逆轉錄酶;溫度;時間 </p><p><b>　　0 引言 </b></p><p&

2、gt;　　建立cDNA文庫并從中篩選出目的基因是一種十分有效的尋找未知基因的手段.cDNA文庫的構建過程可粗分為總RNA的提取，mRNA的純化，cDNA的合成以及將cDNA克隆入載體等幾個主要步驟，其中cDNA的合成是其中最復雜也是文庫建立成敗的關鍵步驟.我們在建立肝癌細胞cDNA文庫時經(jīng)歷了多次cDNA的合成過程，對其中的某些條件作了比較研究，得到了一些有益的經(jīng)驗. </p><p><b>　　1

3、材料和方法 </b></p><p>　　1.1 材料 合成cDNA所用mRNA是從肝癌細胞系HHCC提取;禽源反轉錄酶AMV系Promega公司產(chǎn)品;基因工程反轉錄酶ExpandTM Reverse Transcriptase系寶靈曼公司產(chǎn)品;［α32 P］-dCTP系北京亞輝生物醫(yī)學工程公司產(chǎn)品;紫外分光光度計Spectrometer lambda14系Perkin Elmer公司產(chǎn)品;放射性計

4、數(shù)儀Radiation Monitor系美國SE公司產(chǎn)品. </p><p>　　1.2 合成cDNA時反轉錄酶的選擇 mRNA經(jīng)過紫外分光光度計驗證其純度并準確定量后分成2份，1份以AMV為反轉錄酶，另1份以ExpandTM Reverse Transcriptase為反轉錄酶，2份反應均以Oligo（dT）15 為引物，在反應體系中加入［α32 P］-dCTP.反應結束后進行14g&#12539;L

5、-1 的堿性瓊脂糖凝膠電泳，壓上X光片.24h后顯影以觀察合成效果，具體操作參照文獻［1］.相同實驗至少重復3次. </p><p>　　1.3 cDNA合成過程中反應溫度和時間的控制 在確定了反轉錄酶的種類之后，將cDNA合成反應分成2組，進行兩種不同溫度和時間過程的控制.第1組按傳統(tǒng)方法，即以42℃，60min合成cDNA第一鏈，然后16℃，4h合成cDNA第二鏈;第2組以42℃，45min然后升溫至48℃

6、，15min合成cD-NA第一鏈，以12℃，60min，22℃，60min合成cDNA第二鏈，兩組同樣以［α32 P］-dCTP摻入法驗證cDNA合成效果.同位素摻入情況以cDNA電泳后放射性計數(shù)儀測得的每分鐘計數(shù)為準. </p><p><b>　　2 結果和討論 </b></p><p>　　2.1 構建cDNA文庫對反轉錄酶的質量要求高 經(jīng)過多次重復實驗，證實

7、以AMV為反轉錄酶合成的cDNA第一鏈比較正常，片段分布區(qū)域較寬，而第二鏈合成卻有比較突出的缺陷，片段分布范圍較窄（小于4.0kb），片段集中區(qū)分子量偏?。ㄐ∮?.0kb），有明顯的降解現(xiàn)象.這種結果可能與AMV本身含有較強的RNaseH活性及在酶的生產(chǎn)過程中難以避免污染有核酶內切酶有關［2］ .以ExpandTM Reverse Transcrip-tase為反轉錄酶合成的cDNA兩鏈均正常，特別是cDNA第二鏈分布較廣（從0.3～9

8、.0kb），且片段集中區(qū)在2.0kb上下，完全符合哺乳動物細胞mRNA的分布規(guī)律.此酶為基因工程產(chǎn)品，它的RNaseH活性已被突變掉，且它的生產(chǎn)過程也可避免外源性污染.構建文庫的逆轉錄反應有它不同于其他逆轉錄反應（如RT-PCR）的特點:cDNA合成反應進行的時間長，合成的cDNA片段長度不均一且片段大小分布范圍廣.所以它對反轉錄酶的要求也較高，我們在構建文庫時應充分考慮這一點. </p><p>　　2.2 c

9、DNA合成反應時間可以縮短 放射性計數(shù)值與cD-NA的合成量是呈正相關的，我們對3次實驗中2組不同溫度、時間控制下合成的cDNA進行了計數(shù).結果組1的3次反應計數(shù)值分別為16850，16778和16760r&#12539;min-1 （平均值為16796r&#12539;min-1 ）.組2的3次反應計數(shù)值分別為16876，16802和17118r&#12539;min-1 （平均值為16932r&#1

10、2539;min </p><p>　　-1 ）.2組計數(shù)值雖略有差別，但無統(tǒng)計學意義，說明在2組反應條件下cDNA的合成效果相當.第2組反應條件是我們針對酶的特性制定的［3］ ，當反轉錄酶作用42℃，45min時，大部分mRNA模板會被反轉錄成cDNA第一鏈，但可能也有少數(shù)二級結構較復雜的mRNA不能被反轉錄.當我們升溫至48℃再反應15min，可以將這部分有復雜二級結構的mRNA反轉錄成cDNA.cDNA第二

11、鏈合成時，先在12℃低溫反應，以保證RNaseH在低活性狀態(tài)下即能在mRNA/cDNA雜合鏈上使mRNA產(chǎn)生缺口，又不至于產(chǎn)生大的缺失，再將反應陡升至22℃以便最大限度地發(fā)揮DNA聚合酶活性，快速將mRNA置換成cDNA第二鏈，這樣就大大縮短了反應時間（較傳統(tǒng)方法縮短2h），提高了工作效率. </p><p><b>　　參考文獻: </b></p><p>　　［

12、1］薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T（金冬雁，黎孟楓等譯）.分子克隆實驗指南［M］.第2版.北京:科學出版社，1992:437-441. </p><p>　?。?］Verma IM.Reverse transcripatase.In:Boyer PD ed.The en-zymes ［M］.3rd ed.New York:Academic Press，1981;14:87-95. </p>