草酸氧化酶基因轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜brassicanapusl.的研究

1、草酸氧化酶基因轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜的研究摘 要甘藍(lán)型油菜是 世界重要的 經(jīng)濟(jì)作物之一， 但是由 于長期受到菌核病等多種病害的危害， 其產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán) 重影響。 在中國， 油 菜菌核病居油菜三大 病害之首， 嚴(yán)重影k 1了我國的油菜生產(chǎn)。目 前， 其近緣種中 還沒有發(fā)現(xiàn)完全抗或免疫的種質(zhì)資源， 油 菜對(duì)菌核病的抗性表現(xiàn)為數(shù)量性狀， 易受環(huán)境的影響， 加之缺乏準(zhǔn)確可靠的病害鑒定方 法， 使得常規(guī)育種難以選擇到真正抗病植 株。 因此， 利用植物基

2、因工程， 轉(zhuǎn)入外 源抗真菌基因使油菜獲得對(duì)菌核病的 抗性無 疑成為油 菜抗病育種的一條可行的新途徑。 根據(jù)致 病的 關(guān)鍵因子去尋求控制策略是最根本的途 徑。 根據(jù) 致病的關(guān)鍵因 子去尋求控制策略是 最根本的途徑。 由于產(chǎn)生高 度致 病因子 一草酸， 因此引 入編碼草酸降 解酶的基因來獲得 對(duì)分 泌草酸病原 真菌的 抗性是一個(gè)極具前途的 方法。 為研究草酸 氧化酶基因 ( O x a l a t e o x i d a s eg e n

3、 e , O x O ) 對(duì)植物抗病的作用及獲得抗菌核 病油 菜植株， 本研究以甘藍(lán)型油菜( B r a s s i c an a p u s ) 為 試 材， 將 來自 于 小 麥的 草 酸 氧 化 酶 基因 進(jìn)行 了 農(nóng) 桿菌 遺傳 轉(zhuǎn) 化， 主 要 工 作及結(jié)果如下;1 . 適宜農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立以甘藍(lán)型油菜 ( B r a s s i c a n a p u s ) 常規(guī)品種0 3 6 0 3 , 0 3 7 0 9 ,

4、 P 1 3 7 . 0 4 Y 3 3 5 等為材料，油菜下胚軸和子葉柄作為轉(zhuǎn)化受體， 建立了 適宜的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系。油菜轉(zhuǎn)化再生系統(tǒng)中最適培養(yǎng)基為:I ‘預(yù)培養(yǎng)基: MS 十I m g / L 2 . 4 - D十 0 . 2 m g / L 6 - B AI I . 分化培養(yǎng)基F 1 : M S + 2 . 5 m g / L 6 - B A + 0 . 2 m g / L N A A 十 4 0 0

5、m g / L C b + 6 m g / L A g N 0 3 ,p H 5 . 8I I . 分化培養(yǎng)基F 2 : M S + 2 - 3 m g / L 6 - B A + 0 . 0 1 m g / L N A A + 4 0 0 m g / L C b + 6 m g / L A g N O 3 ,p H 5 . 8I V . 篩 選 培 養(yǎng)基S , 、 S 2 , , S 3 : 分 別為

6、分 化 培 養(yǎng) 基F : 分別 加1 5 , 2 0 , 2 5 m g / L K m， p H5 . 8v . 篩 選 培 養(yǎng)基S 4 . S 5 1 S 6 : 分 別 為 分 化 培 養(yǎng) 基F 2 分 別 加1 5 , 2 0 , 2 5 m 叭 K m， p H 5 . 8v i .生根培養(yǎng)基:1 / 2 M S + 0 . 1 m g / L I B A + 3 0 0 m g / L C e

7、 f , p H 5 . 8 或1 / 2 M S + 0 . 1 m g / L N A A+ 3 0 0 m g / L C e f , p H 5 . 82 . 卡那霉素抗性苗的獲得用對(duì)數(shù)分裂中期 O D 6 o為。 . 3 -0 . 4左右的農(nóng)桿菌菌液稀釋 3 -5 倍侵染 3 -5 mi n ,通過與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，經(jīng)卡那霉素篩選，得到油菜卡那霉素抗性苗 2 0 3 株。3 . 抗性苗的分子生物學(xué)檢測S T

8、UDY ON T R ANS F ORMA T I ON OFB r a s s i c a n a p u s L WI T HOXALATE OXI DAS E GENEABS TRACTR a p e s e e d ( B r a s s i c a n a p u s L ) i s o n e o f t h e m o s t i m p o r t a n t i n d u s t

9、r i a l c r o p s i n t h e w o r l d .H o w e v e r , t h i s c r o p h a s b e e n s u f e r i n g f r o m t h e d e s t r u c t i v e d i s e a s e o f S c l e r o t i n i a s c l e r o t i o r u mf o

10、r a l o n g t i me . I n C h i n a , S c l e r o t i n i a s c l e r o t i o r u m i s t h e f i r s t o n e o f t h e t h r e e m o s t s e r i o u sd i s e a s e s o f r a p e a n d a f e c t s t h

11、 e r a p e p r o d u c t i o n g r e a t l y . Af t e r l o n g t i me p r a c t i c e , n oc o m p l e t e l y r e s i s t a n t c u l t i v a r s h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n r a p e s e e d ,

12、 a s w e l l a s i n t h e c l o s e l y r e l a t e ds p e c i e s . R e s i s t a n c e t o S c l e r o t i n i a s c l e r o t i o r u m i n r a p e s e e d i s q u a n t i t a t i v e t r a i t a n d

13、 e a s i l ya f e c t e d b y e n v i r o n me n t c o n d i t i o n . T h e r e i s n o a c c e p t e d w i d e l y i d e n t i f i c a t i o n r e s i s t a n c em e t h o d . T h e s e q u e s t i o n s m

14、 a k e b r e e d e r s d i f i c u l t t o s e l e c t r e a l l y r e s i s t a n t p l a n t s F o r t u n a t e l yt h e s u c c e s s e o n p l a n t g e n e t i c e n g i n e e r i n g h a s b r o u g

15、 h t l i g h t t o t h e d i f i c u l t y . P e o p l e b e g a n t or e s o r t t o i t a n d s e v e r a l s u c c e s s f u l r e s u l t s h a v e b e e n r e p o r t e d r e c e n t l y . I t i s

16、 a f u n d a m e n t a l w a yt o s e e k c o n t r o l m e t h o d b a s e d o n t h e d e t e r m i n a n t f a c t o r o f p a t h o g e n e s i s . A i m i n g a t o x a l i c a c i d ,t h e m a j o

17、 r p a t h o g e n i c i t y f a c t o r o f S . s c l e r o t i o r u m , t h e i n t r o d u c t i o n a n d e x p r e s s i o n o f g e n e se n c o d i n g e n z y m e s t h a t d e g r a d e o x a l i

18、 c a c i d i s a p o t e n t i a l p o w e r f u l s t r a t e g y t o e n h a n c er e s i s t a n c e t o t h e f u n g i t h a t s e c r e t e o x a l i c a c i d . I n o r d e r t o s t u d y t h

19、e p o s s i b i l i t y o f u t i l i z i n go x a l a t e o x i d a s e g e n e ( O x O ) t o i n c r e a s e p l a n t ' s r e s i s t a n c e a r i o b t a i n t h e r e s i s t a n t r a p e ,B r a

20、 s s i c a n a p u s w e r e t r a n s f o r m e d b y u s i n g A g r c 5 a c ! e r ' : 二 ! u m e f a c i e n s h a r b o u r i n g t h ep l a s m i d c o n t a i n i n g O x O f r o m w h e a t . T h

21、e m a i n w o r k a n d r e s u l t s w e r e a s f o l l o w s :1 . E s t a b l i s h m e n t o f A g r o b a c t e r i u m t u m e 戶 c i e n s - m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n s y s t e m sB r

22、 a s s i c a n a p u s 0 3 6 0 3 , 0 3 7 0 9 , P 1 3 7 , 0 4 Y 3 3 5 w e r e u s e d f o r t r a n s f o r m a t i o n e x p e r i m e n t .T h e c o t y l e d o n p e t i o l e a n d h y p o c o t y l s f

23、 r o m B r a s s i c a n a p u s w e r e t r a n s f o r m e d a s a c c e p t o r .O p t i m u m A g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s - m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n s y s t e m s w e

24、 r e e s t a b l i s h e d .O p t i m u m m e d i u m f o r B r a s s i c a n a p u s t r a n s f o r m a t i o n :I . p r e - c u l t u r e m e d i u m : M S + 1 m g / L 2 . 4 - D + 0 . 2 m g / L 6 - B AI I

25、 . d i f e r e n t i a t i o n me d i u m F , : MS + 2 . 5 m g / L 6 - B A + 0 . 2 m g / L N A A + 4 0 0 m g / L C b + 6 mg / LA g N 0 3 , p H 5 . 8I I I . d i f e r e n t i a t i o n m e d i u m F 2 : M