Rho激酶信號通路在Endothelin-1誘導的人氣道平滑肌細胞遷移和細胞骨架變化中的作用.pdf

1、研究背景及目的： 支氣管哮喘(Bronchialasthma，asthma)是一種氣道慢性炎癥性、過敏性疾病，氣道重塑(Airwayremodeling)是慢性支氣管哮喘重要病理學特征，主要表現(xiàn)為氣道基底膜增厚和上皮下纖維化、氣道平滑肌的肥厚、增殖、細胞外基質(zhì)蛋白的沉積，炎性細胞浸潤和腺體增生肥大等等。而作為氣道中數(shù)目和體積最大的細胞：氣道平滑肌細胞(Airwaysmoothmusclecell，ASMC)，在哮喘氣道重塑中發(fā)揮

2、重要的作用，被認為是哮喘氣道重塑的關鍵細胞。ASMC的收縮、增殖、肥大、分泌細胞外基質(zhì)蛋白等促進氣道重塑的發(fā)生發(fā)展，并進一步加重氣道高反應性(AirwayHyperreactivity，AHR)。 近年來有研究發(fā)現(xiàn)，ASMC也具有遷移的功能，這種遷移與動脈粥樣硬化時血管平滑肌細胞(Vascularsmoothmusclecell，VSMC)的遷移相類似，因此可以推測：哮喘時ASMC在細胞外基質(zhì)的影響和各種細胞因子、炎癥介質(zhì)和生長

3、因子的聯(lián)合作用下，ASMC向氣道內(nèi)膜定向移動并發(fā)生增殖，導致氣道壁的增厚和狹窄，雖然目前還缺乏ASMC向氣道內(nèi)膜直接遷移的證據(jù)，但有研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘患者氣道活檢組織標本中，氣道固有層內(nèi)發(fā)現(xiàn)的肌纖維母細胞在顯微結(jié)構、形態(tài)學和位置方面都與ASMC極其相似，提示肌纖維母細胞可能是ASMC遷移并轉(zhuǎn)化而來，ASMC的遷移的研究是近來的熱點之一，但對于ASMC遷移的機制目前還不十分清楚。 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，細胞因子和炎癥介質(zhì)包括PDGF、IL-

4、1β、尿激酶、半胱氨酸白三烯、LPA等能夠趨化ASMC的遷移，而作為哮喘時氣道內(nèi)一種重要的炎癥介質(zhì)，內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)是目前已知的收縮支氣管最強烈的物質(zhì)之一，哮喘時氣道上皮損傷后表達增多，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它能誘導許多類型的細胞例如嗜酸性粒細胞(EOS)、血管平滑肌細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞、表皮黑素細胞等遷移，但ET-1能否誘導ASMC的趨化遷移，目前還缺乏相關研究。 Rho/Rho激酶信號通路是細胞內(nèi)重要

5、的信號通路，Rho激酶(ROCK)是該通路的關鍵分子，越來越多的證據(jù)表明該通路參與了哮喘時氣道高反應性(AHR)的形成、EOS向BALF聚集、氣道重塑等多種病理生理過程，但該通路在ASMC遷移中報道甚少。因此，本實驗主要對以下兩個方面進行研究：一)研究ET-1對ASMC的誘導遷移作用。二)初步探討Rho激酶信號通路在ASMC遷移中的作用。 材料與方法： 1、經(jīng)患者同意，取南方醫(yī)院胸外科同期做肺葉切除術患者的正常肺葉、段支

6、氣管標本。 2、組織塊貼壁法培養(yǎng)人支氣管平滑肌細胞(Airwaysmoothmusclecell，ASMC)，光鏡下觀察和細胞免疫組化進行ASMC鑒定。 3、使用改良的boydenchamber小室檢測不同濃度ET-1作用下ASMC的跨膜遷移能力的變化，5ng/ml的PDGF作為陽性對照。 4、不同濃度的Rho激酶特異抑制劑Y-27632阻斷Rho激酶信號通路，觀察該信號通路在ET-1誘導的ASMC遷移中的作用。

7、 5、FITC標記的鬼筆環(huán)肽標記F-肌動蛋白骨架，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察ASMC細胞骨架的變化。 6、Westernblot檢測ET-1作用不同時間Rho激酶信號通路下游底物肌球蛋白磷酸酶目標亞單位1(myosin-phosphatasetarget1,MYPT1)的磷酸化水平，以反應Rho激酶信號通路的活化狀況。 7、采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行結(jié)果分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(-x±S)表示，組間比較用

8、one-wayANOVA分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1、ASMC的形態(tài)及免疫組化鑒定：倒置顯微鏡下單個ASMC呈長梭形，貼壁生長至融合后，細胞呈現(xiàn)出特征的“峰谷”狀形態(tài)。細胞免疫組化平滑肌細胞表型標志物a-actin鑒定，光鏡下可見細胞漿中較多棕黃色顆粒為染色陽性細胞。 2、ET-1在0.1、1、10、100nmol/L濃度有誘導ASMC跨膜遷移的作用，遷移細胞數(shù)目分別為(25.2±1.56)

9、、(36.03±2.94)、(49.80±4.47)、(37.96±3.59)個，ET-1濃度在10nmol/L趨化ASMC跨膜遷移能力最強，與對照組(19.08±2.06)個相比，二者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。5ng/ml的PDGF能顯著誘導ASMC遷移(87.73±6.14)個，與對照組(19.08±2.06)相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 3、Rho激酶抑制劑Y-27632呈濃度依賴性抑制ET-1(10n

10、mol/L)誘導的ASMC跨膜遷移，且隨著其濃度的增加，抑制作用越明顯，Y-27632濃度為0.4/μmol/L、2μmol/L、10μmol/L時遷移細胞數(shù)目分別為(44.26±2.50)、(34.56±1.67)、(20.93±1.84)個，其中Y-27632濃度10μmol/L時顯著抑制ASMC的跨膜遷移，與Y27632(0μmol/L)組(48.30±2.64)個相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 4、激光共聚焦觀

11、察細胞骨架：空白對照組細胞有少量短而細的應力纖維，無絲狀偽足形成。ET-1(10nmol/L)刺激30min細胞即發(fā)生伸展，應力纖維形成增多；加入Rho激酶特異抑制劑Y-27632(10μmol/L)預處理后，細胞輪廓變細，偽足及應力纖維少見。 5、westernblot：ET-1(10nmol/L)處理15min、30min、1h、2h、6h、12h、24h后，磷酸化MYPT1(p-MYPT1)蛋白的相對表達量分別為：0.68

12、±0.04、0.66±0.10、0.44±0.06、0.48±0.14、0.43±0.13、0.39±0.10、0.28±0.05。與空白組(0.37±0.03)相比，ET-1處理15min、30min后p-MYPT1表達水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)：隨著時間的延長，p-MYPT1表達程度減弱，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 結(jié)論： ET-1能夠激活Rho激酶信號通路，且在一定濃度范圍