四株南極來(lái)源真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及抗腫瘤活性研究.pdf

1、兩極地區(qū)的自然環(huán)境具有低溫、干旱、強(qiáng)輻射等特點(diǎn),這也造就了極地微生物在基因組成、酶學(xué)特性以及代謝調(diào)控等方面獨(dú)特的分子生物學(xué)機(jī)制與生理生化特性。近年來(lái)的研究顯示,極地微生物在低溫適應(yīng)機(jī)制、新藥開(kāi)發(fā)、新型酶制劑研制、新型保健食品開(kāi)發(fā)等方面具有廣闊的前景。本論文以南極陸地來(lái)源的真菌作為研究對(duì)象,開(kāi)展活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和生物活性研究。研究?jī)?nèi)容主要包括:活性菌株的分離篩選、代謝產(chǎn)物的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定、部分化合物生合成途徑的推測(cè)、單體化合物生

2、物活性的初步評(píng)價(jià)、活性化合物作用靶點(diǎn)的初步探討。
　　從采自南極長(zhǎng)城站及中山站附近的苔蘚下層土、地衣下層土和苔蘚等7個(gè)樣品中共分離得到真菌200株,放線菌17株,采用P388細(xì)胞毒活性篩選,結(jié)合TLC及HPLC化學(xué)篩選模型,得到6株活性真菌,從中選取苔蘚下層土來(lái)源的樹(shù)粉孢屬真菌Oidiodendron truncatum GW3-13、地衣下層土來(lái)源的子囊菌亞門(mén)真菌Ascomycota sp.GW31-6、苔蘚來(lái)源的繩狀青霉Pen

3、icillium funiculosumGWT2-24和苔蘚來(lái)源的桔青霉Penicillium citrinum GW8-28共四株真菌作為本論文的研究對(duì)象。
　　對(duì)四株目標(biāo)活性菌株發(fā)酵產(chǎn)物利用萃取、薄層色譜、硅膠柱色譜、LH-20凝膠柱色譜、反相高效液相色譜等提取分離純化手段,從樹(shù)粉孢屬真菌Oidiodendron truncatum GW3-13的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到了32個(gè)單體化合物(1-32);從子囊菌亞門(mén)真菌Ascomyc

4、ota sp.GW31-6的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到了6個(gè)單體化合物(33-38);從繩狀青霉Penicillium funiculosum GWT2-24的發(fā)酵產(chǎn)物中分離并解析了16個(gè)單體化合物(39-54);從桔青霉Penicillium citrinumGW8-28共分離純化得到5個(gè)單體化合物(56-60)。
　　利用理化性質(zhì)和波譜學(xué)方法(IR,UV,MS,NMR,CD,X-ray)闡明T60個(gè)單體化合物的結(jié)構(gòu)(Fig.1),結(jié)構(gòu)

5、類(lèi)型包括:甾體類(lèi)化合物4個(gè)(31,32,56,57)、萜類(lèi)化合物11個(gè)(26-28,39-46)、二酮哌嗪類(lèi)化合物17個(gè)(1-17)、苯的衍生物類(lèi)化合物24個(gè)(18-25,29,30,33-36,47-54,58,59),吡喃酮類(lèi)化合物1個(gè)(60),環(huán)己烯類(lèi)化合物1個(gè)(37),苯醌類(lèi)化合物1個(gè)(38)。其中發(fā)現(xiàn)新化合物23個(gè),包括7個(gè)含多硫鍵的二酮哌嗪類(lèi)化合物及其衍生物(1,2,4-7,11)、3個(gè)較罕見(jiàn)的氨基酸α位被羥基或者甲氧基取代

6、的二酮哌嗪類(lèi)化合物(13,15,16)、5個(gè)苯的衍生物(33,34,35,48,49;其中化合物33含有1個(gè)獨(dú)特的縮酮螺環(huán)結(jié)構(gòu))、1個(gè)帶有環(huán)氧結(jié)構(gòu)的環(huán)己烯類(lèi)化合物(37)、一個(gè)苯醌類(lèi)化合物(38)、6個(gè)混源萜類(lèi)化合物(39,40,42.45)。在構(gòu)型確定方面,我們采用NOESY、CD并結(jié)合化學(xué)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)推測(cè)了含硫二酮哌嗪類(lèi)化合物(1,2,4-7)的絕對(duì)構(gòu)型。
　　采用MTT法和SRB法,對(duì)分離得到的單體化合物的抗腫瘤活性進(jìn)行了初步評(píng)

7、價(jià),從中篩選出了7個(gè)活性化合物(細(xì)胞毒IC50＜10μM)(1-4,9-11)。進(jìn)一步采用ELISA等方法對(duì)活性化合物的分子靶點(diǎn)和作用機(jī)制進(jìn)行初步探索。其中:1.新的Epipolythiodioxopiperazines類(lèi)化合物(1)對(duì)HCT-8、Bel-7402、BGC-823、A-549和A2780細(xì)胞的IC50分別為0.013、0.003、0.011、0.022和0.028μM;該化合物在10μM時(shí)對(duì)蛋白激酶具有抑制作用,抑制率分

8、別為C-Met(49.5％),RET(64.1％),ABL(61.2％);化合物(1)對(duì)HIF-1的抑制活性具有劑量依賴(lài)性;初步的實(shí)驗(yàn)表明化合物(1)對(duì)小鼠H22肝癌移植瘤模型具有體內(nèi)抗腫瘤活性;目前對(duì)化合物(1)的臨床前藥效學(xué)評(píng)價(jià)正在進(jìn)行當(dāng)中。
　　本論文從4株真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中共分離鑒定了54個(gè)化合物,其中18個(gè)新化合物。新化合物1,2,4-7和11為首次報(bào)道的南極嗜冷真菌來(lái)源的的含硫二酮哌嗪類(lèi)化合物,新化合物13,15和16

9、為含硫二酮哌嗪生合成過(guò)程的支路產(chǎn)物;評(píng)價(jià)了22個(gè)單體化合物的抗腫瘤活性,發(fā)現(xiàn)了7個(gè)活性較強(qiáng)的化合物,其中化合物(1)體外細(xì)胞和分子水平有效,是一個(gè)新穎的多靶點(diǎn)的抗腫瘤先導(dǎo)化合物;初步評(píng)價(jià)了含硫二酮哌嗪類(lèi)化合物的HIF-1抑制活性。共分離篩選獲得6株抗腫瘤活性菌株,發(fā)現(xiàn)了能產(chǎn)生系列抗腫瘤活性化合物的樹(shù)粉孢屬真菌Oidiodendrontruncatum GW3-13、新種真菌GW31-6和繩狀青霉Penicillium funiculos